The widespread availability of energy-dense, rewarding foods is correlated with the increased incidence of obesity across the globe. Overeating during mealtimes and unscheduled snacking disrupts timed metabolic processes, which further contribute to weight gain. The neuronal mechanism by which the consumption of energy-dense food restructures the timing of feeding is poorly understood. Here, we demonstrate that dopaminergic signaling within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the central circadian pacemaker, disrupts the timing of feeding, resulting in overconsumption of food. D1 dopamine receptor (Drd1)-null mice are resistant to diet-induced obesity, metabolic disease, and circadian disruption associated with energy-dense diets. Conversely, genetic rescue of Drd1 expression within the SCN restores diet-induced overconsumption, weight gain, and obesogenic symptoms. Access to rewarding food increases SCN dopamine turnover, and elevated Drd1-signaling decreases SCN neuronal activity, which we posit disinhibits downstream orexigenic responses. These findings define a connection between the reward and circadian pathways in the regulation of pathological calorie consumption.

Abstract Development of the mammalian brain requires precisely controlled differentiation of neurons, glia, and nonneural cells. To investigate protein-level changes in these diverse cell types and their progenitors, we performed single-cell mass cytometry on whole brain (E11.5/E12.5) and microdissected telencephalon, diencephalon, mesencephalon, and rhombencephalon (E13.5–P4) collected at daily timepoints from C57/BL6 mice. Measuring 24,290,787 cells from 112 sample replicates with a 40-antibody panel, we quantified 85 molecularly distinct cell populations across embryonic and postnatal development, including microglia putatively phagocytosing neurites, neural cells, and myelin. Differentiation trajectory analysis also identified two separate pathways for producing oligodendrocyte precursor cells. Comparison with previous studies revealed considerable discrepancies between protein and mRNA abundances in the developing brain, demonstrating the value of protein-level measurements for identifying functional cell states. Overall, our findings demonstrate the utility of mass cytometry as a high-throughput, scalable platform for single-cell profiling of brain tissue.

Abstract Neuronal derived extracellular vesicles (EVs) have been well described in the central nervous system; however, studies in the peripheral nervous system have largely focused on EVs derived from supporting cell types such as endothelial cells or glia. Here we isolate EVs derived from sympathetic neurons and characterize them using immunoblot assays, nanoparticle tracking analysis and cryo-electron microscopy. Sizing of sympathetic EVs reveal a predominant peak between 45-75 nm as well as a range of larger sizes (90 nm to >350 nm), possibly due to multiple biogenic origins. We identified TrkA, a receptor for nerve growth factor (NGF), as a cargo for sympathetic EVs. Furthermore, TrkA on EVs was phosphorylated, indicating activated TrkA receptor. TrkA binds NGF at the axonal tip and is endocytosed and transported to the soma in signaling endosomes. We therefore examined if TrkA originating in the axon tip was subsequently able to be packaged into EVs and secreted by the somatodendritic domain of neurons. Using a compartmentalized culture system, we found that TrkA derived from endosomes originating in the distal axon can be detected on EVs secreted from the somatodendritic domain. In addition, inhibition of classic TrkA downstream pathways, specifically in somatodendritic compartments greatly decreases TrkA packaging into EVs. Our results suggest a novel trafficking route for TrkA: it can travel long distances to the cell body, be packaged into EVs and secreted. Secretion of TrkA via EVs appears to be regulated by its own downstream effector cascades, raising intriguing future questions about novel functionalities associated with TrkA positive EVs.

Abstract Depression is a prevalent psychological condition with limited treatment options. While its etiology is multifactorial, both chronic stress and changes in the microbiome are associated with disease pathology. In depression, stress is known to induce microbiome dysbiosis, defined here as a change in microbial composition associated with a pathological condition. This state of dysbiosis is then known to feedback on depressive symptoms. While studies have demonstrated that targeted restoration of the microbiome can alleviate depressive-like symptoms in mice, translating these findings to human patients has proven challenging due to the complexity of the human microbiome. As such, there is an urgent need to identify factors upstream of microbial dysbiosis. Here we investigate the role of mucin 13 as an upstream mediator of microbiome composition changes. Using a model of chronic stress, we show that the mucosal protein, mucin 13, is selectively reduced after psychological stress exposure. We further demonstrate that the reduction of Muc13 is mediated by the Hnf4 transcription factor family. Finally, we determine that deleting Muc13 is sufficient to drive microbiome shifts and despair behaviors. These findings shed light on the mechanisms behind stress-induced microbial changes and reveal a regulator of mucin 13 expression. Summary In this paper, authors identified a pathway by which stress induces microbiome shifts. They found that psychological stress selectively alters a key mucosal protein, mucin 13, which in turn modifies the microbial niche to induce changes in bacterial composition.

ABSTRACT Circulating glucose regulates organismal energy homeostasis and is tightly controlled in response to feeding behavior. In overweight individuals, glucose homeostasis is often perturbed due to resistance to normal satiety signals, such as insulin and leptin, leading to type 2 diabetes and its attendant complications. An emerging dietary intervention, time-restricted feeding (TRF), aims to ameliorate the adverse metabolic consequences of obesity, however, its effectiveness on glucose control is uncertain. Here, we demonstrate that TRF is only transiently effective in reducing pre-meal serum glucose levels in obese mice lacking leptin. However, in Ob/Ob mice that also lack a gene known to suppress behavior associated with TRF, the p75 neurotrophin receptor (p75NTR), a sustained reduction of glucose levels is observed. These results suggest that the effectiveness of TRF on glycemic control can be enhanced with concurrent targeting of modulators of glucose homeostasis and TRF response.

Abstract Salient cues, such as the rising sun or the availability of food, play a crucial role in entraining biological clocks, allowing for effective behavioral adaptation and ultimately, survival. While the light-dependent entrainment of the central circadian pacemaker (suprachiasmatic nucleus, SCN) is relatively well defined, the molecular and neural mechanisms underlying entrainment associated with food availability remains elusive. Using single nucleus RNA sequencing during scheduled feeding (SF), we identified a leptin receptor (LepR) expressing neuron population in the dorsomedial hypothalamus (DMH) that upregulates circadian entrainment genes and exhibits rhythmic calcium activity prior to an anticipated meal. We found that disrupting DMH LepR neuron activity had a profound impact on both molecular and behavioral food entrainment. Specifically, silencing DMH LepR neurons, mis-timed exogenous leptin administration, or mis-timed chemogenetic stimulation of these neurons all interfered with the development of food entrainment. In a state of energy abundance, repetitive activation of DMH LepR neurons led to the partitioning of a secondary bout of circadian locomotor activity that was in phase with the stimulation and dependent on an intact SCN. Lastly, we discovered that a subpopulation of DMH LepR neurons project to the SCN with the capacity to influence the phase of the circadian clock. This leptin regulated circuit serves as a point of integration between the metabolic and circadian systems, facilitating the anticipation of meal times.

ABSTRACT Microglia play a critical role in maintaining central nervous system (CNS) homeostasis and display remarkable plasticity in their response to inflammatory stimuli. However, the specific signaling profiles that microglia adopt during such challenges remain incompletely understood. Traditional transcriptomic approaches provide valuable insights, but fail to capture dynamic post‐translational changes. In this study, we utilized time‐resolved single‐cell mass cytometry (CyTOF) to measure distinct signaling pathways activated in microglia upon exposure to bacterial and viral mimetics—lipopolysaccharide (LPS) and polyinosinic‐polycytidylic acid (Poly(I:C)), respectively. Furthermore, we evaluated the immunomodulatory role of astrocytes on microglial signaling in mixed cultures. Microglia or mixed cultures derived from neonatal mice were treated with LPS or Poly(I:C) for 48 h. Cultures were stained with a panel of 33 metal‐conjugated antibodies targeting signaling and identity markers. High‐dimensional clustering analysis was used to identify emergent signaling modules. We found that LPS treatment led to more robust early activation of pp38, pERK, pRSK, and pCREB compared to Poly(I:C). Despite these differences, both LPS and Poly(I:C) upregulated the classical reactivity markers CD40 and CD86 at later time points. Strikingly, the presence of astrocytes significantly blunted microglial responses to both stimuli, particularly dampening CD40 upregulation. Our studies demonstrate that single‐cell mass cytometry effectively captures the dynamic signaling landscape of microglia under pro‐inflammatory conditions. This approach may pave the way for targeted therapeutic investigations of various neuroinflammatory disorders. Moreover, our findings underscore the necessity of considering cellular context, such as astrocyte presence, in interpreting microglial behavior during inflammation.

The regressive events associated with trophic deprivation are critical for sculpting a functional nervous system. After nerve growth factor withdrawal, sympathetic axons maintain their structural integrity for roughly 18 hours (latent phase) followed by a rapid and near unison disassembly of axons over the next 3 hours (catastrophic phase). Here we examine the molecular basis by which axons transition from latent to catastrophic phases of degeneration following trophic withdrawal. Prior to catastrophic degeneration, we observed an increase in intra-axonal calcium. This calcium flux is accompanied by p75 neurotrophic factor receptor (NTR)-Rho-actin dependent expansion of calcium rich axonal spheroids that eventually rupture, releasing their contents to the extracellular space. Conditioned media derived from degenerating axons is capable of hastening transition into the catastrophic phase of degeneration. We also found that death receptor 6 (DR6) but not p75NTR is required for transition into the catastrophic phase in response to conditioned media but not for the intra-axonal calcium flux, spheroid formation, or rupture that occurs toward the end of latency. Our results support the existence of an inter-axonal degenerative signal that promotes catastrophic degeneration among trophically deprived axons.

Abstract Motoneurons are one of the highest energy demanding cell types and a primary target in Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), a debilitating and lethal neurodegenerative disorder without currently available effective treatments. Disruption of mitochondrial ultra-structure, transport and metabolism is a commonly reported phenotype in ALS models and can critically affect survival and proper function of motor neurons. However, how changes in metabolic rates contribute to ALS progression are not fully understood yet. Here we utilize hiPCS derived motoneuron cultures and live imaging quantitative techniques to evaluate metabolic rates in Fused in Sarcoma (FUS)-ALS model cells. We show that differentiation and maturation of motoneurons is accompanied by an overall upregulation of mitochondrial components and significant increase in metabolic rates that corresponds to their high energy-demanding state. Detailed compartment-specific live measurements using a fluorescent ATP sensor and FLIM imaging show significantly lower levels of ATP in the somas of cells carrying FUS-ALS mutations. These changes lead to the increased vulnerability of disease motoneurons to further metabolic challenges with mitochondrial inhibitors and could be due to the disruption of mitochondrial inner membrane integrity and an increase in its proton leakage. Furthermore, our measurements demonstrate heterogeneity between axonal and somatic compartments with lower relative levels of ATP in axons. Our observations strongly support the hypothesis that mutated FUS impacts metabolic states of motoneurons and makes them more susceptible to further neurodegenerative mechanisms.