ABSTRACT Despite their identification in some cancers, pro-tumoral cancer-associated fibroblasts (CAFs) were presumed absent in glioblastoma given the lack of brain fibroblasts. Serial trypsinization of primary glioblastoma cultures yielded cells with CAF morphology, CAF transcriptomic profile, and mesenchymal lineage in single-cell RNA-seq. Glioblastoma CAFs were attracted to glioblastoma stem cells (GSCs) and CAFs enriched GSCs. We created a resource of inferred crosstalk by mapping expression of receptors to their cognate ligands, identifying PDGF-β and TGF-β as mediators of GSC effects on CAFs, and osteopontin and hepatocyte growth factor as mediators of CAF-induced GSC enrichment. Glioblastoma CAFs also induced M2 macrophage polarization by producing the EDA fibronectin variant. Glioblastoma CAFs were enriched in the subventricular zone which houses neural stem cells that produce GSCs. Including CAFs in GSC-derived xenografts induced in vivo growth. These findings are among the first to identify glioblastoma CAFs and their GSC interactions, making them an intriguing target.

Tumor-associated neutrophil (TAN) effects on glioblastoma biology remain under-characterized. We show here that 'hybrid' neutrophils with dendritic features - including morphological complexity, expression of antigen presentation genes, and the ability to process exogenous peptide and stimulate MHCII-dependent T cell activation - accumulate intratumorally and suppress tumor growth in vivo . Trajectory analysis of patient TAN scRNA-seq identifies this phenotype as a polarization state which is distinct from canonical cytotoxic TANs and differentiates intratumorally from immature precursors absent in circulation. Rather, these hybrid-inducible immature neutrophils - which we identified in patient and murine glioblastomas - arise from local skull marrow. Through labeled skull flap transplantation and targeted ablation, we characterize calvarial marrow as a potent contributor of antitumoral myeloid APCs, including hybrid TANs and dendritic cells, which elicit T cell cytotoxicity and memory. As such, agents augmenting neutrophil egress from skull marrow - such as intracalvarial AMD3100 whose survival prolonging-effect in GBM we demonstrate - present therapeutic potential.

Fibroblasts coordinate the response to tissue injury, directing organ regeneration versus scarring. In the central nervous system (CNS), fibroblasts are uncommon cells enriched at tissue borders, and their molecular, cellular, and functional interactions after brain injury are poorly understood. Here we define the fibroblast response to sterile brain damage across time and space. Early pro-fibrotic myofibroblasts infiltrated CNS lesions and were functionally and spatially organized by fibroblast TGF β signaling, pro-fibrotic macrophages and microglia, and perilesional brain glia that activated TGF β via integrin α v β 8 . Early myofibroblasts subsequently transitioned into a variety of late states, including meningeal and lymphocyte-interactive fibroblasts that persisted long term. Interruption of this dynamic fibroblast-macrophage-glial coordination impaired brain wound healing and the resolution of neuroinflammation, disrupted generation of late de novo CNS lymphocyte niches, and increased mortality in a stroke model. This work highlights an unexpected role of fibroblasts as coordinate regulators of CNS healing and neuroinflammation after brain injury.

Metastases cause 90% of human cancer deaths. The metastatic cascade involves local invasion, intravasation, extravasation, metastatic site colonization, and proliferation. While individual mediators of these processes have been investigated, interactions between these mediators remain less well defined. We previously identified a structural complex between receptor tyrosine kinase c-Met and β1 integrin in metastases. Using novel cell culture and in vivo assays, we found that c-Met/β1 complex induction promotes breast cancer intravasation and adhesion to the vessel wall, but does not increase extravasation. These effects may be driven by the ability of the c-Met/β1 complex to increase mesenchymal and stem cell characteristics. Multiplex transcriptomic analysis revealed upregulated Wnt and hedgehog pathways after c-Met/β1 complex induction. A β1 integrin point mutation that prevented binding to c-Met reduced intravasation. OS2966, a therapeutic antibody disrupting c-Met/β1 binding, decreased invasion and mesenchymal gene expression and morphology of breast cancer cells. Bone-seeking breast cancer cells exhibited higher c-Met/β1 complex levels than parental controls and preferentially adhere to tissue-specific matrix. Patient bone metastases demonstrated higher c-Met/β1 levels than brain metastases. Thus, the c-Met/β1 complex drives breast cancer cell intravasation and preferential affinity for bone tissue-specific matrix. Pharmacological targeting of the complex may prevent metastases, particularly osseous metastases.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

While the poor prognosis of glioblastoma arises from the invasion of a subset of tumor cells, little is known of the metabolic alterations within these cells that fuel invasion. We integrated spatially addressable hydrogel biomaterial platforms, patient site-directed biopsies, and multi-omics analyses to define metabolic drivers of invasive glioblastoma cells. Metabolomics and lipidomics revealed elevations in the redox buffers cystathionine, hexosylceramides, and glucosyl ceramides in the invasive front of both hydrogel-cultured tumors and patient site-directed biopsies, with immunofluorescence indicating elevated reactive oxygen species (ROS) markers in invasive cells. Transcriptomics confirmed upregulation of ROS-producing and response genes at the invasive front in both hydrogel models and patient tumors. Amongst oncologic ROS, hydrogen peroxide specifically promoted glioblastoma invasion in 3D hydrogel spheroid cultures. A CRISPR metabolic gene screen revealed cystathionine gamma lyase (CTH), which converts cystathionine to the non-essential amino acid cysteine in the transsulfuration pathway, to be essential for glioblastoma invasion. Correspondingly, supplementing CTH knockdown cells with exogenous cysteine rescued invasion. Pharmacologic CTH inhibition suppressed glioblastoma invasion, while CTH knockdown slowed glioblastoma invasion in vivo. Our studies highlight the importance of ROS metabolism in invasive glioblastoma cells and support further exploration of the transsulfuration pathway as a mechanistic and therapeutic target.