Abstract Tc toxins are modular toxin systems that are composed of a pentameric membrane translocator (TcA) and a cocoon (TcB and TcC) encapsulating the toxic enzyme. Binding of Tcs to target cells and a pH shift trigger the conformational transition from the soluble prepore state to the membrane-embedded pore. Subsequently, the toxic enzyme is translocated and released into the cytoplasm. Here, we show in atomic detail an assembled Tc toxin complex from P. luminescens in the membrane. We find that the five TcA protomers conformationally adapt to fit around the cocoon during prepore-to-pore transition. The architecture of the Tc toxin complex also allows TcB-TcC to bind to an already membrane-embedded TcA pore to form a holotoxin. Mammalian lipids with zwitterionic head groups are preferred over other lipids for Tc toxin integration. The translocated toxic enzyme, which can be partially visualized, transiently interacts with alternating negative charges and hydrophobic stretches.

ABSTRACT Canonical transient receptor potential channels (TRPC) are involved in receptor-operated and/or store-operated Ca 2+ signaling. Inhibition of TRPCs by small molecules was shown to be promising in treating renal diseases. In cells, the channels are regulated by calmodulin. Molecular details of both calmodulin and drug binding have remained elusive so far. Here we report structures of TRPC4 in complex with a pyridazinone-based inhibitor and a pyridazinone-based activator and calmodulin. The structures reveal that both activator and inhibitor bind to the same cavity of the voltage-sensing-like domain and allow us to describe how structural changes from the ligand binding site can be transmitted to the central ion-conducting pore of TRPC4. Calmodulin binds to the rib helix of TRPC4, which results in the ordering of a previously disordered region, fixing the channel in its closed conformation. This represents a novel calmodulin-induced regulatory mechanism of canonical TRP channels.

Abstract The release of inorganic phosphate (P i ) from actin filaments constitutes a key step in their regulated turnover, which is fundamental to many cellular functions. However, the molecular mechanisms underlying P i release from both the core and barbed end of actin filaments remain unclear. Here, we combine cryo-EM with molecular dynamics simulations and in vitro reconstitution to demonstrate how actin releases P i through a ‘molecular backdoor’. While constantly open at the barbed end, the backdoor is predominantly closed in filament-core subunits and only opens transiently through concerted backbone movements and rotameric rearrangements of residues close to the nucleotide binding pocket. This mechanism explains why P i escapes rapidly from the filament end and yet slowly from internal actin subunits. In an actin variant associated with nemaline myopathy, the backdoor is predominantly open in filament-core subunits, resulting in greatly accelerated P i release after polymerization and filaments with drastically shortened ADP-P i caps. This demonstrates that the P i release rate from F-actin is controlled by steric hindrance through the backdoor rather than by the disruption of the ionic bond between P i and Mg 2+ at the nucleotide-binding site. Our results provide the molecular basis for P i release from actin and exemplify how a single, disease-linked point mutation distorts the nucleotide state distribution and atomic structure of the actin filament.

Abstract The bacterial Makes caterpillars floppy 1 (Mcf1) toxin promotes apoptosis in insects, leading to loss of body turgor and death. The molecular mechanism underlying Mcf1 intoxication is poorly understood. Here, we present the cryo-EM structure of Mcf1 from Photorhabdus luminescens , revealing a seahorse-like shape with a head and tail. While the three head domains contain two effectors, an activator-binding domain (ABD) and an autoprotease, the tail consists of two translocation as well as three receptor-binding domains. Rearrangement of the tail moves the C-terminus away from the ABD and allows binding of the host cell ADP-ribosylation factor 3, inducing conformational changes that position the cleavage site closer to the protease. This unique activation mechanism that is based on a hook-loop interaction results in three autocleavage reactions and the release of two toxic effectors. Unexpectedly, the BH3-like domain containing ABD is not an active effector. Our findings allow us to understand key steps of Mcf1 intoxication at the molecular level.

The BBSome is a heterooctameric protein complex that plays a central role in primary cilia homeostasis. Its malfunction causes the severe ciliopathy Bardet-Biedl syndrome (BBS). The complex acts as a cargo adapter that recognizes signaling proteins such as GPCRs and links them to the intraflagellar transport machinery. The underlying mechanism is poorly understood. Here we present a high-resolution cryo-EM structure of a human heterohexameric core subcomplex of the BBSome. The structure reveals the architecture of the complex in atomic detail. It explains how the subunits interact with each other and how disease-causing mutations hamper this interaction. The complex adopts a conformation that is open for binding to membrane-associated GTPase Arl6 and a large positively charged patch likely strengthens the interaction with the membrane. A prominent negatively charged cleft at the center of the complex is likely involved in binding of positively charged signaling sequences of cargo proteins.

Canonical transient receptor channels (TRPC) are non-selective cation channels. They are involved in receptor-operated Ca2+ signaling and have been proposed to act as store-operated channels (SOC). Their malfunction is related to cardiomyopathies and their modulation by small molecules has been shown to be effective against renal cancer cells. The molecular mechanism underlying the complex activation and regulation is poorly understood. Here, we report the electron cryo-microscopy structure of zebrafish TRPC4 in its unliganded (apo), closed state at an overall resolution of 0.36 nm. The structure reveals the molecular architecture of the cation conducting pore, including the selectivity filter and lower gate. The cytoplasmic domain contains two key hubs that have been shown to interact with modulating proteins. Structural comparisons with other TRP channels give novel insights into the general architecture and domain organization of this superfamily of channels and help to understand their function and pharmacology.