Abstract After acute brain injuries various response cascades are evoked that direct the formation of the glial scar. Here, we report that acute lesions associated with a disruption of the blood-brain barrier trigger a re-programming within the oligodendrocyte lineage. In PLP-DsRed1/GFAP-EGFP and PLP-EGFP mem /GFAP-mRFP1 transgenic mice with cortical injuries, we transiently found PLP transgene-labelled cells with activated GFAP promoter activity adjacent to the lesion site. We termed them AO cells, based on their concomitant activity of a stro- and o ligodendroglial genes. By fate mapping using PLP- and GFAP-split Cre complementation and NG2-CreER T2 mice we observed that major portions of AO cells surprisingly differentiated into astrocytes. Using repeated long-term in vivo two-photon laser-scanning microscopy (2P-LSM) we followed oligodendrocytes after injury. We observed their conversion into astrocytes via the AO cell stage with silencing of the PLP promoter and simultaneous activation of the GFAP promoter. In addition, we provide evidence that this oligodendrocyte-to-astrocyte conversion depends on local cues. At the lesion site higher expression levels of various glial differentiation factors were detected. And indeed, local injection of IL-6 promoted the formation of AO cells. In summary, our findings highlight the plastic potential of oligodendrocytes in acute brain trauma. An altered environmental milieu affects gene expression programs of mature oligodendrocytes and induces a plastic differentiation stage with astrogliogenic potential via transitional AO cells.

Abstract Molecular pathways mediating systemic inflammation entering the brain parenchyma to induce sepsis-associated encephalopathy (SAE) remain elusive. Here, we report that in mice during the first 6 hours of peripheral lipopolysaccharide (LPS)-evoked systemic inflammation (6 hpi), the plasma level of adenosine quickly increased and enhanced the tone of central extracellular adenosine which then provoked neuroinflammation by triggering early astrocyte reactivity. Specific ablation of astrocytic Gi protein-coupled A1 adenosine receptors (A1ARs) prevented this early reactivity and reduced the levels of inflammatory factors (e.g., CCL2, CCL5, and CXCL1) in astrocytes, thereby alleviating microglial reaction, ameliorating blood-brain barrier disruption, peripheral immune cell infiltration, neuronal dysfunction, and depression-like behaviour in the mice. Chemogenetic stimulation of Gi signaling in A1AR-deficent astrocytes at 2 and 4 hpi of LPS injection could restore neuroinflammation and depression-like behaviour, highlighting astrocytes rather than microglia as early drivers of neuroinflammation. Our results identify early astrocyte reactivity towards peripheral and central levels of adenosine as an important pathway driving SAE and highlight the potential of targeting A1ARs for therapeutic intervention.

Abstract Natural killer (NK) cells play a vital role in eliminating tumorigenic cells. Efficient locating and killing of target cells in complex three-dimensional (3D) environments are critical for their functions under physiological conditions. However, the role of mechanosensing in regulating NK cell killing efficiency in physiologically relevant scenarios is poorly understood. Here, we report that the responsiveness of NK cells is regulated by tumor cell stiffness. NK cell killing efficiency in 3D is impaired against softened tumor cells, while it is enhanced against stiffened tumor cells. Notably, the durations required for NK cell killing and detachment are significantly shortened for stiffened tumor cells. Furthermore, we have identified PIEZO1 as the predominantly expressed mechanosensitive ion channel among the examined candidates in NK cells. Perturbation of PIEZO1 abolishes stiffness-dependent NK cell responsiveness, significantly impairs the killing efficiency of NK cells in 3D, and substantially reduces NK cell infiltration into 3D collagen matrices. Conversely, PIEZO1 activation enhances NK killing efficiency as well as infiltration. In conclusion, our findings demonstrate that PIEZO1-mediated mechanosensing is crucial for NK killing functions, highlighting the role of mechanosensing in NK cell killing efficiency under 3D physiological conditions and the influence of environmental physical cues on NK cell functions.

Abstract Cortical neural circuits are complex but very precise networks of balanced excitation and inhibition (E/I). Yet, the molecular and cellular mechanisms that form the E/I balance are just beginning to emerge. Here, using conditional GABA B receptor-deficient mice we identified a GABA/TNF-related cytokine (TNFSF12)-mediated bidirectional communication pathway between Parvalbumin-positive (PV + ) fast spiking interneurons and oligodendrocyte precursor cells (OPCs) that determines the density and function of interneurons in the developing medial prefrontal cortex (mPFC). Interruption of the GABAergic signaling to OPCs resulted in reduced myelination and hypoactivity of interneurons, strong changes of cortical network activities and impaired cognitive behavior. In conclusion, glial transmitter receptors are pivotal elements in finetuning distinct brain functions.

Abstract Visualizing interactions between cells and the extracellular matrix (ECM) mesh is important to understand cell behavior and regulatory mechanisms by the extracellular environment. However, long term visualization of three-dimensional (3D) matrix structures remains challenging mainly due to photobleaching or blind spots perpendicular to the imaging plane. Here, we combine label-free light-sheet scattering microcopy (LSSM) and fluorescence microscopy to solve these problems. We verified that LSSM can reliably visualize structures of collagen matrices from different origin including bovine, human and rat tail. The quality and intensity of collagen structure images acquired by LSSM did not decline with time. LSSM offers abundant wavelength choice to visualize matrix structures, maximizing combination possibilities with fluorescently-labelled cells, allowing visualizing of long-term ECM-cell interactions in 3D. Interestingly, we observed ultrathin thread-like structures between cells and matrix using LSSM, which were not observed by normal fluorescence microscopy. Transient local alignment of matrix by cell-applied forces can be observed. In summary, LSSM provides a powerful and robust approach to investigate the complex interplay between cells and ECM.

Abstract In vivo, immune killer cells must infiltrate into tissues and search for their cognate target cells in 3D environments. To investigate the cytotoxic function of immune killer cells, there is currently a significant need for an in vitro kinetic assay that resembles 3D in vivo features. Our work presents a high-throughput kinetic killing assay in 3D that is a robust and powerful tool for evaluating the killing efficiency of immune killer cells, as well as the viability of tumor cells under in vivo-like conditions. This assay holds particular value for assessing primary human CTLs and NK cells and can also be applied to primary murine killer cells. By utilizing collagen concentrations to mimic healthy tissue, soft tumors, and stiff tumors, this assay enables the evaluation of cell function and behavior in physiologically and pathologically relevant scenarios, particularly in the context of solid tumors. Furthermore, this assay shows promise as a personalized strategy for selecting more effective drugs/treatments against tumors, using primary immune cells for individual patients to achieve improved clinical outcomes.

Abstract Effective T cell responses against tumor cells require diverse effector functions including polarization towards tumor cells to form immunological synapses and nuclear factor of activated T-cells (NFAT)-dependent gene transcription. While the role of tumor cell softening has been associated with malignancy, stemness, and metastasis, potentially contributing to immune evasion, its impact on cellular processes in T cells is not well understood. Here, we show that both T cell polarization and NFAT nuclear translocation are modulated by target stiffness in a Ca 2+ dependent manner. Using both anti-CD3 antibody-functionalized substrates with varying stiffness as surrogates for target cells or softened tumor cells, we found that both, reorientation of microtubule organizing center (MTOC) towards the tumor cells, a hallmark for T cell polarization, and NFAT translocation were impaired on softer hydrogels or following contact with softer cancer cells. The amplitudes of intracellular Ca 2+ signals were dependent on stiffness, and removal of extracellular Ca 2+ inhibited stiffness-dependent T cell responsiveness. While stiffness-dependent Ca 2+ signaling was crucial for both, T cell polarization and NFAT translocation, Ca 2+ influx through Piezo1, a mechanosensitive ion channel, mediated stiffness-dependent MTOC reorientation but not NFAT translocation. In contrast, Ca 2+ influx through store-operated Orai channels mediated NFAT translocation but not MTOC reorientation. Our results demonstrate that tumor cell stiffness directly influences T cell functionality through distinct Ca 2+ influx pathways, revealing cell softening as an essential mechanism employed by malignant cells to evade immune surveillance.

Abstract Oligodendrocyte precursor cells (OPCs) shape brain function through intricate regulatory mechanisms. Here, we observed that OPC processes establish connections with neuronal somata, with smaller lysosomes positioned near these contact sites. Tracking lysosomes demonstrated neuronal lysosomes were attracted to and released at these contact points, eventually becoming incorporated into OPC processes, suggesting a selective, OPC-evoked release of lysosomes from neuronal soma and their ingestion by OPCs, highlighting a unique lysosome-mediated communication between neurons and OPCs. Diminished branching of OPC processes resulted in fewer neuron-OPC contacts, fostering larger lysosome accumulation in neurons, altered neuronal activity and escalated prevalence of senescent neurons during aging. A similar reduction in OPC branching and neuronal lysosome accumulation was evident in an early-stage Alzheimer’s disease mouse model. Together, these findings underscore the pivotal role of OPC processes in modulating neuronal activity through direct somatic contact and lysosome ingestion, presenting a prospective therapeutic avenue for addressing neurodegenerative diseases.

Abstract Natural killer (NK) cells play a key role in eliminating pathogen-infected cells. Verbena officinalis ( V. officinalis ) has been used as a medical plant in traditional and modern medicine, exhibiting anti-tumor and anti-inflammation activities, but its roles in immune responses still remains largely elusive. In this work, investigated the regulation of inflammation and NK functions by V. officinalis extract (VO-extract). In an influenza virus infection mouse model, oral administration of VO-extract alleviated lung injury, promoted maturation and activation of NK cells residing in the lung, and decreased the levels of inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α and IL-1β) in the serum. We further analyzed the impact of five bioactive components of VO-extract on NK killing functions. Among them, Verbenalin enhanced NK killing efficiency significantly as determined by real-time killing assays based on plate-reader or high-throughput live-cell imaging in 3D using primary human NK cells. Further investigation showed that treatment of Verbenalin accelerated killing processes by reducing the contact time of NK cells with their target cells without affecting NK proliferation, expression of cytotoxic proteins, or lytic granule degranulation. Together, our findings reveal that low doses of V. officinalis can achieve a satisfactory anti-inflammation effect against viral infection in vivo , and V. officinalis regulates activation, maturation and killing functions of NK cells. NK killing efficiency is enhanced by Verbenalin from V. officinalis , suggesting a promising potential of verbenalin to fight viral infection.

Abstract Mechanotransduction events in physiological environments are difficult to investigate, in part due to the lack of experimental tools to apply forces to mechanosensitive receptors remotely. Inspired by cellular mechanisms for force application (i.e. motor proteins pulling on cytoskeletal fibers), here we present a unique molecular machine that can apply forces at cell-matrix and cell-cell junctions using light as an energy source. The key actuator is a light-driven rotatory molecular motor linked to polymer chains, which is intercalated between a membrane receptor and an engineered biointerface. The light-driven actuation of the molecular motor is converted in mechanical twisting of the polymer chains, which will in turn effectively “pulls” on engaged cell membrane receptors (integrins, cadherins…) within the illuminated area. Applied forces have the adequate magnitude and occur at time scales within the relevant ranges for mechanotransduction at cell-friendly exposure conditions, as demonstrated in forcedependent focal adhesion maturation and T cell activation experiments. Our results reveal the potential of nanomotors for the manipulation of living cells at the molecular scale and demonstrate, for the first time, a functionality which at the moment cannot be achieved by any other means.