Neuroblastoma is a common pediatric cancer, where preclinical studies suggest that a mesenchymal-like gene expression program contributes to chemotherapy resistance. However, clinical outcomes remain poor, implying we need a better understanding of the relationship between patient tumor heterogeneity and preclinical models. Here, we generated single-cell RNA-seq maps of neuroblastoma cell lines, patient-derived xenograft models (PDX), and a genetically engineered mouse model (GEMM). We developed an unsupervised machine learning approach ('automatic consensus nonnegative matrix factorization' (acNMF)) to compare the gene expression programs found in preclinical models to a large cohort of patient tumors. We confirmed a weakly expressed, mesenchymal-like program in otherwise adrenergic cancer cells in some pre-treated high-risk patient tumors, but this appears distinct from the presumptive drug-resistance mesenchymal programs evident in cell lines. Surprisingly however, this weak-mesenchymal-like program was maintained in PDX and could be chemotherapy-induced in our GEMM after only 24 hours, suggesting an uncharacterized therapy-escape mechanism. Collectively, our findings improve the understanding of how neuroblastoma patient tumor heterogeneity is reflected in preclinical models, provides a comprehensive integrated resource, and a generalizable set of computational methodologies for the joint analysis of clinical and pre-clinical single-cell RNA-seq datasets.

Despite the well-established significance of transcription factors (TFs) in pathogenesis, their utilization as pharmacological targets has been limited by the inherent challenges associated with modulating their protein-protein and protein-DNA interactions. The lack of defined small-molecule binding pockets and the nuclear localization of TFs do not favor the use of small-molecule inhibitors, or neutral antibodies, in blocking TF interactions. Aptamers are short oligonucleotides exhibiting high affinity and specificity for a diverse range of targets. Large molecular weights, expansive blocking surfaces and efficient cellular internalization make aptamers a compelling molecular tool for use as traditional TF interaction modulators. Here, we report a structure-guided design strategy called Blocker-SELEX to develop inhibitory aptamers (iAptamer) that selectively block TF interactions. Our approach led to the discovery of iAptamers that cooperatively disrupts SCAF4/SCAF8-RNA Polymerase II (RNAP2) interactions, thereby dysregulating RNAP2-dependent gene expression and splicing and, in turn, leading to the impairment of cell proliferation. This approach was further applied to develop iAptamers to efficiently block WDR5-MYC interaction with a nexus in cancer. Taken together, our study highlights the potential of Blocker-SELEX in developing iAptamers that effectively disrupt potentially pathogenic TF interactions with attendant implications for iAptamers as chemical tools for use in the study of biological functions of TF interactions, but also for potential use in nucleic acids drug discovery.

ABSTRACT Combination chemotherapy is crucial for achieving durable cancer cures, however, developing safe and effective drug combinations has been a significant challenge. To improve this process, we conducted large-scale targeted CRISPR knockout screens in drug-treated cells, creating a genetic map of druggable genes that sensitize cells to commonly used chemotherapeutics. We prioritized neuroblastoma, the most common pediatric solid tumor, where 50% of high-risk patients do not survive. Our screen examined all druggable gene knockouts in 18 cell lines (10 neuroblastoma, 8 others) treated with 8 widely used drugs, resulting in 94,320 unique combination-cell line perturbations, which is comparable to the largest drug combination screens ever reported. Remarkably, using dense drug-drug rescreening, we found that the top CRISPR-nominated drug combinations were far more synergistic than standard-of-care combinations, suggesting existing combinations could be improved. As proof of principle, we discovered that inhibition of PRKDC, a component of the non-homologous end-joining pathway, sensitizes high-risk neuroblastoma cells to the standard-of-care drug doxorubicin in vitro and in vivo using PDX models. Our findings provide a valuable resource for the development of improved chemotherapeutic strategies and demonstrate the feasibility of using targeted CRISPR knockout to discover new combinations with common chemotherapeutics, a methodology with application across all cancers.

ABSTRACT CLEC16A regulates mitochondrial health through mitophagy and is associated with over 20 human diseases. While CLEC16A has ubiquitin ligase activity, the key structural and functional regions of CLEC16A, and their relevance for human disease, remain unknown. Here, we report that a disease-associated CLEC16A variant lacks a C-terminal intrinsically disordered protein region (IDPR) that is critical for mitochondrial quality control. Using carbon detect NMR, we find that the CLEC16A C terminus lacks secondary structure, validating the presence of an IDPR. Loss of the CLEC16A C-terminal IDPR in vivo impairs pancreatic β-cell mitophagy, mitochondrial function, and glucose-stimulated insulin secretion, ultimately causing glucose intolerance. Deletion of the CLEC16A C-terminal IDPR increases its self-ubiquitination and destabilizes CLEC16A, thus impairing formation of a critical CLEC16A-dependent mitophagy complex. Importantly, CLEC16A stability is dependent on proline bias within the C-terminal IDPR, but not amino acid sequence order or charge. Together, we clarify how an IDPR in CLEC16A prevents diabetes, thus implicating the disruption of IDPRs as novel pathological contributors to diabetes and other CLEC16A-associated diseases.

Retinoic acid (RA) is a standard-of-care neuroblastoma drug thought to be effective by inducing differentiation. Curiously, RA has little effect on primary human tumors during upfront treatment but can eliminate neuroblastoma cells from the bone marrow during post-chemo consolidation therapy-a discrepancy that has never been explained. To investigate this, we treated a large cohort of neuroblastoma cell lines with RA and observed that the most RA-sensitive cells predominantly undergo apoptosis or senescence, rather than differentiation. We conducted genome-wide CRISPR knockout screens under RA treatment, which identified BMP signaling as controlling the apoptosis/senescence vs differentiation cell fate decision and determining RA's overall potency. We then discovered that BMP signaling activity is markedly higher in neuroblastoma patient samples at bone marrow metastatic sites, providing a plausible explanation for RA's ability to clear neuroblastoma cells specifically from the bone marrow, seemingly mimicking interactions between BMP and RA during normal development.

Abstract To adapt to the change of intertidal environment, intertidal macroalgae have evolved complicated Ci utilization mechanism. However, our knowledge regarding the CO2 concentrating mechanism (CCM) of macroalgae is limited. Carbonic anhydrase (CA), a key component of CCM, plays important roles in many physiological reactions in various organisms. While there are a large number of genes encoding CA in the Pyropia yezoensis genome, the exact function of specific CA in P. yezoensis remains elusive. To explore the specific function of chloroplast CA in intertidal macroalgae, we produced chloroplast-localized βCA1 knockdown mutants of P. yezoensis through RNA interference, and Pyca1i mutants showed a notable decrease in leaf area and overall biomass, as well as decreased soluble protein and unsaturated fatty acid content under different DIC conditions. However, Pyca1i mutants showed relatively higher starch content compared to the wild-type. The activity of enzymes involved in Calvin cycle, photorespiration, Pentose-phosphate pathway and floridean starch synthesis of P.yezoensis indicated an effective starch accumulation pathway after interference of βCA1. All results suggest that the decreased activity of PyβCA1 impaired the CCM and development of thalli of P.yezoensis, but stimulated starch accumulation in the cytoplasm through feedback to the photorespiration pathway and PP pathway to replenish intermediates for the Calvin cycle. This study is the first to explore the specific function of chloroplast CA in intertidal macroalgae using genomic technology. The results provide valuable insights into the adaption mechanisms of intertidal macroalgae to their environment.