SUMMARY Homologous recombination (HR) is a conservative DNA repair pathway in which intact homologous sequences are used as a template for repair. How the homology search happens in the crowded space of the cell nucleus is, however, still poorly understood. Here, we measured global chromosome and double-strand break (DSB) site mobility in Arabidopsis thaliana , using lacO /LacI lines and two GFP-tagged HR reporters. We observed an increase in global chromatin mobility upon the induction of DNA damage, specifically at the S/G2 phases of the cell cycle. DSB sites showed remarkably high mobility levels at the early HR stage, with a subsequent drastic decrease in mobility associated with the relocation of DSBs to the nucleus periphery. Importantly, the increase in mobility was lost in sog1-1 mutant, a central transcription factor of the DNA damage response in plants. Our results indicate that repair mechanisms actively regulate chromatin mobility upon DNA damage, implying an important role for this process during the early steps of the DNA damage response.

Abstract The shift from outcrossing to self-fertilization is one of the main evolutionary transitions in plants, and has broad effects on evolutionary trajectories. In Brassicaceae, the ability to impede self-fertilization is controlled by two genes, SCR and SRK, tightly linked within the S-locus. A series of small non-coding RNAs also encoded within the S-locus regulates the transcriptional activity of SCR alleles, resulting in a linear dominance hierarchy between them. Brassicaceae allopolyploid species are often self-compatible (SC) even when one of their parents is self-incompatible, but the causes of the loss of self-incompatibility (SI) in polyploid lineages have generally remained elusive. We used a series of synthetic hybrids obtained between self-fertilizing Capsella orientalis and outcrossing C. grandiflora to test whether the breakdown of SI in allopolyploid species, such as C. bursa-pastoris , could be explained by the dominance interactions between S-haplotypes inherited from the parental lineages. After establishing a database of reference S-allele sequences, we used RNA-sequencing data from young inflorescences to measure allele-specific expression of the SCR and SRK genes in diploid and tetraploid synthetic hybrids. We then compared the observed expression of SCR alleles with the predicted dominance relationship between S-haplotypes in pollen and with the seed set from autonomous self-fertilization in the synthetic hybrids. Our results formally establish that upon hybridization, the immediate effect on the mating system depends on the relative dominance between S-alleles inherited from the parental species. They illustrate that a detailed understanding of the genetic architecture of the control of SI is essential to predict the patterns of association between the mating system and changes in ploidy. Lay summary Polyploidy is the inheritable condition of carrying more than two sets of chromosomes. It can result from within-species genome duplication (auto-polyploidy), or from the merging of sets of chromosomes from different species following hybridization (allo-polyploidy). Because sexual reproduction between individuals of different levels of ploidy is generally not successful, self-fertilization has been considered a key component of the establishment success of polyploid lineages. However, the reasons why the mating system of polyploids may differ from that of their parental species remains mysterious. In plants of the Brassicaceae family, several allopolyploid species arose from hybridization between an outcrossing and a self-fertilizing species, and in most cases the resulting lineages are self-fertilizing. It has been proposed that the mating system of these allopolyploids depends on the dominance relationships between the functional and non-functional self-incompatibility alleles inherited from the parental species. Here, we tested this prediction by characterizing at the transcriptional (RNA-seq) and phenotypic levels (estimation of autonomous seed production) a series of synthetic Capsella diploid and tetraploid hybrids. We found that the predicted dominance relationships matched the observed expression of self-incompatibility alleles, as well as the mating system phenotypes. Hence, the mating system of newly formed Capsella allotetraploids depends on the dominance relationship between self-incompatibility alleles inherited from the parents. Overall, our results improve our understanding of the mechanisms by which changes in ploidy can alter the system of mating over the course of evolution.

Abstract The study of the independent evolution of similar characters can highlight important ecological and genetic factors that drive phenotypic evolution. The transition from reproduction by outcrossing to self-fertilization has occurred frequently throughout plant evolution. A common trend in this transition is the reduction of flower features in the selfing lineages, including display size, flower signals and pollinators’ rewards. These changes are believed to evolve because resources invested in building attractive flowers are reallocated to other fitness functions as the pressures to attract pollinators decrease. We investigated the similarities in the evolution of flower fragrance after independent transitions to self-fertilization in Capsella . We identified a large number of compounds that are similarly changed in different selfer lineages, such that the composition of the flower scent can predict the mating system in this genus. We further demonstrate that the emission of some of these compounds convergently evolved based on mutations in different genes. In one of the Capsella selfing lineages, the loss of β -ocimene emission was caused by a mutation altering subcellular localization of the ortholog of TERPENE SYNTHASE 2 without apparent effects on its biosynthetic activity. This mutation appears to have been selected at the early stage of this selfing lineage establishment through the capture of a variant segregating in the ancestral outcrossing population. The large extent of convergence in the independent evolution of flower scent, together with the evolutionary history and molecular consequences of a causal mutation, suggest that the emission of specific volatiles has important fitness consequences in self-fertilizing plants without obvious energetic benefits.

ABSTRACT Multicellular organisms result from complex developmental processes largely orchestrated through the quantitative spatiotemporal regulation of gene expression. Yet, obtaining absolute counts of mRNAs at a 3-dimensional resolution remains challenging, especially in plants, due to high levels of tissue autofluorescence that prevent the detection of diffraction-limited fluorescent spots. In situ hybridization methods based on amplification cycles have recently emerged, but they are laborious and often lead to quantification biases. In this article, we present a simple method based on single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) to visualize and count the number of mRNA molecules in several intact plant tissues. In addition, with the use of fluorescent protein reporters, our method also enables simultaneous detection of mRNA and protein quantity, as well as subcellular distribution, in single cells. With this method, research in plants can now fully explore the benefits of the quantitative analysis of transcription and protein levels at cellular and subcellular resolution in plant tissues.

Summary Throughout their lifecycle, plants are subjected to DNA damage from various sources, both environmental and endogenous. Investigating the mechanisms of the DNA damage response (DDR) is essential to unravel how plants adapt to the changing environment, which can induce varying amounts of DNA damage. Using a combination of whole‐mount single‐molecule RNA fluorescence in situ hybridization (WM‐smFISH) and plant cell cycle reporter lines, we investigated the transcriptional activation of a key homologous recombination (HR) gene, RAD51 , in response to increasing amounts of DNA damage in Arabidopsis thaliana roots. The results uncover consistent variations in RAD51 transcriptional response and cell cycle arrest among distinct cell types and developmental zones. Furthermore, we demonstrate that DNA damage induced by genotoxic stress results in RAD51 transcription throughout the whole cell cycle, dissociating its traditional link with S/G2 phases. This work advances the current comprehension of DNA damage response in plants by demonstrating quantitative differences in DDR activation. In addition, it reveals new associations with the cell cycle and cell types, providing crucial insights for further studies of the broader response mechanisms in plants.

Summary Allopolyploidization is a frequent evolutionary transition in plants that combines whole-genome duplication (WGD) and interspecific hybridization. The genome of an allopolyploid species results from initial interactions between parental genomes and long-term evolution. Telling apart the contributions of these two phases is essential to understanding the evolutionary trajectory of allopolyploid species. Here, we compared phenotypic and transcriptomic changes in natural and resynthesized Capsella allotetraploids with their diploid parental species. We focused on phenotypic traits associated with the selfing syndrome and on transcription-level phenomena such as expression level dominance, transgressive expression, and homoeolog expression bias. We found that selfing syndrome, high pollen and seed quality in natural allotetraploids likely resulted from long-term evolution. Similarly, transgressive expression and most down-regulated expression-level dominance were only found in natural allopolyploids. Natural allotetraploids also had more expression-level dominance toward the self-fertilizing parental species than resynthesized allotetraploids, mirroring the establishment of the selfing syndrome. However, short-term changes mattered, and 40% of the cases of expression-level dominance in natural allotetraploids were already observed in resynthesized allotetraploids. Resynthesized allotetraploids showed striking variation of homoeolog expression bias among chromosomes and individuals. Homoeologous synapsis was its primary source and may still be a source of genetic variation in natural allotetraploids. In conclusion, both short- and long-term mechanisms contributed to transcriptomic and phenotypic changes in natural allotetraploids. However, the initial gene expression changes were largely reshaped during long-term evolution leading to further morphological changes.

ABSTRACT Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) has emerged as a powerful tool to study gene expression dynamics with unparalleled precision and spatial resolution in a variety of biological systems. Recent advancements have expanded its application to encompass plant studies, yet a demand persists for a simple and robust smFISH method adapted to plant tissue sections. Here, we present an optimized smFISH protocol (cryo-smFISH) for visualizing and quantifying single mRNA molecules in plant tissue cryosections. This method exhibits remarkable sensitivity, capable of detecting low-expression transcripts, including long non-coding RNAs. Integrating a deep learning-based algorithm in our image analysis pipeline, our method enables us to assign RNA abundance precisely in nuclear and cytoplasmic compartments. Compatibility with Immunofluorescence also allows RNA and endogenous proteins to be visualized and quantified simultaneously. Finally, this study presents for the first time the use of smFISH for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) validation in plants. By extending the smFISH method to plant cryosections, an even broader community of plant scientists will be able to exploit the multiple potentials of quantitative transcript analysis at cellular and subcellular resolutions.

Whether, and to what extent, phenotypic evolution follows predictable genetic paths, remains an important question in evolutionary biology. Convergent evolution of similar characters provides a unique opportunity to address this question. The transition to selfing and the associated changes in flower morphology are among the most prominent examples of repeated evolution in plants. Yet, to date no studies have directly compared the extent of similarities between convergent adaptations to selfing. In this study, we take advantage of the independent transitions to self-fertilization in the genus Capsella to test the existence of genetic and developmental constraints imposed on flower evolution in the context of the selfing syndrome. While C. rubella and C. orientalis have emerged independently, both have evolved almost identical flower characters. Not only the evolutionary outcome is identical but, in both cases, the same developmental strategies underlie the convergent reduction of flower size. This has been associated with convergent evolution of gene-expression changes. The transcriptomic changes common to both selfing lineages are enriched in genes with low-network connectivity and with organ-specific expression patterns. Comparative genetic mapping also indicates that, at least in the case of petal size evolution, these similarities are largely caused by mutations at the same loci. Together, these results suggest that the limited availability of low-pleiotropy paths predetermine closely related species to similar evolutionary outcomes.