Summary During normal levels of exertion, many cardiac muscle myosin heads are sequestered in an off-state even during systolic contraction to save energy and for precise regulation. They can be converted to an on-state when exertion is increased. Hypercontractility caused by hypertrophic cardiomyopathy (HCM) myosin mutations is often the result of shifting the equilibrium toward more heads in the on-state. The off-state is equated with a folded-back structure known as the interacting head motif (IHM), which is a regulatory feature of all muscle myosins and class-2 non-muscle myosins. We report here the human β-cardiac myosin IHM structure to 3.6 Å resolution. The structure shows that the interfaces are hot spots of HCM mutations and reveals details of the significant interactions. Importantly, the structures of cardiac and smooth muscle myosin IHMs are dramatically different. This challenges the concept that the IHM structure is conserved in all muscle types and opens new perspectives in the understanding of muscle physiology. The cardiac IHM structure has been the missing puzzle piece to fully understand the development of inherited cardiomyopathies. This work will pave the way for the development of new molecules able to stabilize or destabilize the IHM in a personalized medicine approach. *This manuscript was submitted to Nature Communications in August 2022 and dealt efficiently by the editors. All reviewers received this version of the manuscript before 9 208 August 2022. They also received coordinates and maps of our high resolution structure on the 18 208 August 2022. Due to slowness of at least one reviewer, this contribution was delayed for acceptance by Nature Communications and we are now depositing in bioRxiv the originally submitted version written in July 2022 for everyone to see. Indeed, two bioRxiv contributions at lower resolution but adding similar concepts on thick filament regulation were deposited this week in bioRxiv, one of the contributions having had access to our coordinates. We hope that our data at high resolution will be helpful for all readers that appreciate that high resolution information is required to build accurate atomic models and discuss implications for sarcomere regulation and the effects of cardiomyopathy mutations on heart muscle function.

ABSTRACT Human monoclonal antibodies were used here to study the mechanism of neuron intoxication by tetanus neurotoxin protein toxins and as a safe preventive and therapeutic substitute of hyperimmune sera. By screening memory B cells of immune donors, we selected two monoclonal antibodies specific for tetanus neurotoxin with exceptionally high neutralizing activities, which have been extensively characterized both structurally and functionally. We found that these antibodies interfere with the binding and translocation of the neurotoxin into neurons by interacting with two epitopes, whose definition pinpoints crucial events in the cellular pathogenesis of tetanus. Some mechanistic aspects of tetanus neurotoxin intoxication were revealed, explaining at the same time, the unprecedented neutralization ability of these antibodies. Importantly, these antibodies are exceptionally efficient in preventing experimental tetanus when injected in mice long before the neurotoxin. Moreover, their Fab derivatives neutralize tetanus neurotoxin in post-exposure experiments, suggesting their potential therapeutic use upon intrathecal injection. As such, these human monoclonal antibodies, as well as their Fab derivatives, meet all requirements for being considered for prophylaxis and therapy of human tetanus and are ready for clinical trials.

Cryo-EM structures of transcription pre-initiation complex (PIC) and initiation complex (IC) of yeast mitochondrial RNA polymerase show fully resolved transcription bubbles and explain promoter melting, template alignment, DNA scrunching, transition into elongation, and abortive synthesis. Promoter melting initiates in PIC with MTF1 trapping the -4 to -2 non-template (NT) bases in its NT-groove. Transition to IC is marked by a large-scale movement that aligns the template with RNA at the active site. RNA synthesis scrunches the NT strand into an NT-loop, which interacts with centrally positioned MTF1 C-tail. Steric clashes of the C-tail with RNA:DNA and NT-loop, and dynamic scrunching-unscrunching of DNA explain abortive synthesis and transition into elongation. Capturing the catalytically active IC-state with UTPαS poised for incorporation enables modeling toxicity of antiviral nucleosides/nucleotides.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

General transcription factor TFIID is a key component of RNA polymerase II transcription initiation. Human TFIID is a megadalton-sized complex comprising TATA-binding protein (TBP) and 13 TBP-associated factors (TAFs). TBP binds to core promoter DNA, recognizing the TATA-box. We identified a ternary complex formed by TBP and the histone fold (HF) domain-containing TFIID subunits TAF11 and TAF13. We demonstrate that TAF11/TAF13 competes for TBP binding with TATA-box DNA, and also with the N-terminal domain of TAF1 previously implicated in TATA-box mimicry. In an integrative approach combining crystal coordinates, biochemical analyses and data from cross-linking mass-spectrometry (CLMS), we determine the architecture of the TAF11/TAF13/TBP complex, revealing TAF11/TAF13 interaction with the DNA binding surface of TBP. We identify a highly conserved C-terminal TBP-binding domain (CTID) in TAF13 which is essential for supporting cell growth. Our results thus have implications for cellular TFIID assembly and suggest a novel regulatory state for TFIID function.

Abstract Enteric bacteria have to adapt to environmental stresses in the human gastrointestinal tract such as acid and nutrient stress, oxygen limitation and exposure to antibiotics. Membrane lipid composition has recently emerged as a key factor for stress adaptation. The E. coli ravA-viaA operon is essential for aminoglycoside bactericidal activity under anaerobiosis but its mechanism of action is unclear. Here we characterise the VWA domain-protein ViaA and its interaction with the AAA+ ATPase RavA, and find that both proteins localise at the inner cell membrane. We demonstrate that RavA and ViaA target specific phospholipids and subsequently identify their lipid-binding sites. We further show that mutations abolishing interaction with lipids restore induced changes in cell membrane morphology and lipid composition. Finally we reveal that these mutations render E. coli gentamicin-resistant under fumarate respiration conditions. Our work thus uncovers a ravA-viaA -based pathway which is mobilised in response to antibiotics under anaerobiosis and has a major impact on cell membrane regulation.

ABSTRACT The mitochondrial Complex I assembly (MCIA) complex is an essential player in the biogenesis of respiratory Complex I (CI), the multiprotein complex responsible for the initiation of oxidative phosphorylation (OXPHOS). It is not well understood how MCIA facilitates the assembly of CI. Here we report the structural basis of the complex formation between the MCIA subunits ECSIT and ACAD9. ECSIT binding induces a major conformational change in the FAD-binding loop of ACAD9, resulting in efflux of the FAD cofactor and redeployment of ACAD9 from fatty acid β-oxidation (FAO) to CI assembly. We identify an adjacent α-helix as a key structural element that specifically enables the CI assembly functionality of ACAD9, distinguishing it from its closely related VLCAD counterpart. Furthermore, we show that ECSIT is phosphorylated in vitro and ex cellulo and provide evidence that phosphorylation downregulates its association with ACAD9. Interestingly, ECSIT has previously been linked to the pathogenesis of Alzheimer’s disease and here we show that ECSIT phosphorylation in neuronal cells is reduced upon exposure to amyloid-β (Aβ) oligomers. These findings shed light on the assembly of the MCIA complex and implicate ECSIT as a potential reprogrammer of bioenergetic metabolic pathways that can be altered when mitochondria are affected by Aβ toxicity, a hallmark of Alzheimer’s disease.

ABSTRACT Self-assembly and fibril formation play important roles in protein behavior. Amyloid fibrils formation is well-studied due to its role in neurodegenerative diseases and characterized by refolding of the protein into predominant β-sheet form. However, much less is known about the assembly of proteins into other types of supramolecular structures. Using cryo-electron microscopy at a resolution of 1.97 Å, we show that a triple-mutant of the anti-microbial peptide plectasin assembles reversibly into helical non-amyloid fibrils. Plectasin contains a cysteine-stabilized α-helix-β-sheets structure, which remains intact upon fibril formation. Two fibrils form a right-handed superstructure with each fibril consisting of double helical, left-handed structures. The fibril formation is reversible and follows sigmoidal kinetics with a pH-dependent equilibrium between soluble monomer and protein fibril. The anti-microbial activity does not appear compromised by fibril formation. This is the first high-resolution structure of this type of α/β protein fibrils.