Abstract Impairments in neuronal intracellular calcium ( i Ca 2+ ) handling may contribute to Alzheimer’s disease (AD) development. Metabolic dysfunction and progressive neuronal loss are associated with AD progression, and mitochondrial calcium ( m Ca 2+ ) signaling is a key regulator of both of these processes. Here, we report remodeling of the m Ca 2+ exchange machinery in the prefrontal cortex of individuals with AD. In the 3xTg-AD mouse model impaired m Ca 2+ efflux capacity precedes neuropathology. Neuronal deletion of the mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger (NCLX, Slc8b1 gene) accelerated memory decline and increased amyloidosis and tau pathology. Further, genetic rescue of neuronal NCLX in 3xTg-AD mice is sufficient to impede AD-associated pathology and memory loss. We show that m Ca 2+ overload contributes to AD progression by promoting superoxide generation, metabolic dysfunction and neuronal cell death. These results provide a link between the calcium dysregulation and metabolic dysfunction hypotheses of AD and suggest m Ca 2+ exchange as potential therapeutic target in AD.

Highlights•LINC00116 encodes a single-pass transmembrane protein known as mitoregulin (Mtln)•Mtln appears to be a sticky inner mitochondrial membrane protein that binds cardiolipin•Mtln levels influence mitochondrial respiration, ROS, and Ca2+ retention capacity•Mtln-KO mice exhibit deficiencies in FAO, mCa2+ retention, and supercomplexesSummaryMitochondria are composed of many small proteins that control protein synthesis, complex assembly, metabolism, and ion and reactive oxygen species (ROS) handling. We show that a skeletal muscle- and heart-enriched long non-coding RNA, LINC00116, encodes a highly conserved 56-amino-acid microprotein that we named mitoregulin (Mtln). Mtln localizes to the inner mitochondrial membrane, where it binds cardiolipin and influences protein complex assembly. In cultured cells, Mtln overexpression increases mitochondrial membrane potential, respiration rates, and Ca2+ retention capacity while decreasing mitochondrial ROS and matrix-free Ca2+. Mtln-knockout mice display perturbations in mitochondrial respiratory (super)complex formation and activity, fatty acid oxidation, tricarboxylic acid (TCA) cycle enzymes, and Ca2+ retention capacity. Blue-native gel electrophoresis revealed that Mtln co-migrates alongside several complexes, including the complex I assembly module, complex V, and supercomplexes. Under denaturing conditions, Mtln remains in high-molecular-weight complexes, supporting its role as a sticky molecular tether that enhances respiratory efficiency by bolstering protein complex assembly and/or stability.Graphical abstract

MICU1 is an EF-hand-containing mitochondrial protein that is essential for gating of the mitochondrial Ca2+ uniporter channel (mtCU) and is reported to interact directly with the pore-forming subunit, MCU and scaffold EMRE. However, using size-exclusion proteomics, we found that MICU1 exists in mitochondrial complexes lacking MCU. This suggests that MICU1 may have additional cellular functions independent of regulating mitochondrial Ca2+ uptake. To discern mtCU-independent MICU1 functions, we employed a proteomic discovery approach using BioID2-mediated proximity-based (<10nm) biotinylation and subsequent LC-MS detection. The expression of a MICU1-BioID2 fusion protein in MICU1-/- and MCU-/- cells allowed the identification of total vs. mtCU-independent MICU1 interactors. Bioinformatics identified the Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System (MICOS) components MIC60 (encoded by the IMMT gene) and Coiled-coil-helix-coiled-coil helix domain containing 2 (CHCHD2) as novel MICU1 interactors, independent of the mtCU. We demonstrate that MICU1 is essential for proper proteomic organization of the MICOS complex and that MICU1 ablation results in altered cristae organization and mitochondrial ultrastructure. We hypothesize that MICU1 serves as a MICOS calcium sensor, since perturbing MICU1 is sufficient to modulate cytochrome c release independent of mitochondrial Ca2+ uptake across the inner mitochondrial membrane (IMM). Here, we provide the first experimental evidence suggesting that MICU1 regulates cellular functions independent of mitochondrial calcium uptake and may serve as a critical mediator of Ca2+-dependent signaling to modulate mitochondrial membrane dynamics and cristae organization.

ABSTRACT The liver, the largest internal organ and a metabolic hub, undergoes significant declines due to aging, affecting mitochondrial function and increasing the risk of systemic liver diseases. How the mitochondrial three-dimensional (3D) structure changes in the liver across aging, and the biological mechanisms regulating such changes confers remain unclear. In this study, we employed Serial Block Face-Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) to achieve high-resolution 3D reconstructions of murine liver mitochondria to observe diverse phenotypes and structural alterations that occur with age, marked by a reduction in size and complexity. We also show concomitant metabolomic and lipidomic changes in aged samples. Aged human samples reflected altered disease risk. To find potential regulators of this change, we examined the Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System (MICOS) complex, which plays a crucial role in maintaining mitochondrial architecture. We observe that the MICOS complex is lost during aging, but not Sam50. Sam50 is a component of the sorting and assembly machinery (SAM) complex that acts in tandem with the MICOS complex to modulate cristae morphology. In murine models subjected to a high-fat diet, there is a marked depletion of the mitochondrial protein SAM50. This reduction in Sam50 expression may heighten the susceptibility to liver disease, as our human biobank studies corroborate that Sam50 plays a genetically regulated role in the predisposition to multiple liver diseases. We further show that changes in mitochondrial calcium dysregulation and oxidative stress accompany the disruption of the MICOS complex. Together, we establish that a decrease in mitochondrial complexity and dysregulated metabolism occur with murine liver aging. While these changes are partially be regulated by age-related loss of the MICOS complex, the confluence of a murine high-fat diet can also cause loss of Sam50, which contributes to liver diseases. In summary, our study reveals potential regulators that affect age-related changes in mitochondrial structure and metabolism, which can be targeted in future therapeutic techniques. Graphical Abstract Liver aging causes metabolic, lipidomic, and mitochondrial structural alterations, reflecting age-dependent losses in the MICOS complex. Diet-dependent losses of the SAM complex underlie genetic disease associations and mitochondrial structure.

ABSTRACT The kidney filters nutrient waste and bodily fluids from the bloodstream, in addition to secondary functions of metabolism and hormone secretion, requiring an astonishing amount of energy to maintain its functions. In kidney cells, mitochondria produce adenosine triphosphate (ATP) and help maintain kidney function. Due to aging, the efficiency of kidney functions begins to decrease. Dysfunction in mitochondria and cristae, the inner folds of mitochondria, is a hallmark of aging. Therefore, age-related kidney function decline could be due to changes in mitochondrial ultrastructure, increased reactive oxygen species (ROS), and subsequent alterations in metabolism and lipid composition. We sought to understand if there is altered mitochondrial ultrastructure, as marked by 3D morphological changes, across time in tubular kidney cells. Serial block facing-scanning electron microscope (SBF-SEM) and manual segmentation using the Amira software were used to visualize murine kidney samples during the aging process at 3 months (young) and 2 years (old). We found that 2-year mitochondria are more fragmented, compared to the 3-month, with many uniquely shaped mitochondria observed across aging, concomitant with shifts in ROS, metabolomics, and lipid homeostasis. Furthermore, we show that the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex is impaired in the kidney due to aging. Disruption of the MICOS complex shows altered mitochondrial calcium uptake and calcium retention capacity, as well as generation of oxidative stress. We found significant, detrimental structural changes to aged kidney tubule mitochondria suggesting a potential mechanism underlying why kidney diseases occur more readily with age. We hypothesize that disruption in the MICOS complex further exacerbates mitochondrial dysfunction, creating a vicious cycle of mitochondrial degradation and oxidative stress, thus impacting kidney health. Translational Statement Due to aging, the efficiency of kidney functions begins to decrease and the risk of kidney diseases may increase, but specific regulators of mitochondrial age-related changes are poorly explained. This study demonstrates the MICOS complex may be a target for mitigating age-related changes in mitochondria. The MICOS complex can be associated with oxidative stress and calcium dysregulation, which also arise in many kidney pathologies. Graphical Abstract Kidney aging causes a decline in the MICOS complex, concomitant with metabolic, lipidomic, and mitochondrial structural alterations.

All metazoans depend on O2 delivery and consumption by the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system to produce energy. A decrease in O2 availability (hypoxia) leads to profound metabolic rewiring. In addition, OXPHOS uses O2 to produce reactive oxygen species (ROS) that can drive cell adaptations through redox signalling, but also trigger cell damage[1][1]–[4][2], and both phenomena occur in hypoxia[4][2]–[8][3]. However, the precise mechanism by which acute hypoxia triggers mitochondrial ROS production is still unknown. Ca2+ is one of the best known examples of an ion acting as a second messenger[9][4], yet the role ascribed to Na+ is to serve as a mere mediator of membrane potential and collaborating in ion transport[10][5]. Here we show that Na+ acts as a second messenger regulating OXPHOS function and ROS production by modulating fluidity of the inner mitochondrial membrane (IMM). We found that a conformational shift in mitochondrial complex I during acute hypoxia[11][6] drives the acidification of the matrix and solubilization of calcium phosphate precipitates. The concomitant increase in matrix free-Ca2+ activates the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger (NCLX), which imports Na+ into the matrix. Na+ interacts with phospholipids reducing IMM fluidity and mobility of free ubiquinone between complex II and complex III, but not inside supercomplexes. As a consequence, superoxide is produced at complex III, generating a redox signal. Inhibition of mitochondrial Na+ import through NCLX is sufficient to block this pathway, preventing adaptation to hypoxia. These results reveal that Na+ import into the mitochondrial matrix controls OXPHOS function and redox signalling through an unexpected interaction with phospholipids, with profound consequences in cellular metabolism. [1]: #ref-1 [2]: #ref-4 [3]: #ref-8 [4]: #ref-9 [5]: #ref-10 [6]: #ref-11

ABSTRACT Background Mitochondrial calcium ( m Ca 2+ ) uptake through the mitochondrial calcium uniporter channel (mtCU) stimulates metabolism to meet acute increases in cardiac energy demand. However, excessive m Ca 2+ uptake during stress, as in ischemia-reperfusion, initiates permeability transition and cell death. Despite these often-reported acute physiological and pathological effects, a major unresolved controversy is whether mtCU-dependent m Ca 2+ uptake and long-term elevation of cardiomyocyte m Ca 2+ contributes to the heart’s adaptation during sustained increases in workload. Objective We tested the hypothesis that mtCU-dependent m Ca 2+ uptake contributes to cardiac adaptation and ventricular remodeling during sustained catecholaminergic stress. Methods Mice with tamoxifen-inducible, cardiomyocyte-specific gain (αMHC-MCM x flox-stop-MCU; MCU-Tg) or loss (αMHC-MCM x Mcu fl/fl ; Mcu -cKO) of mtCU function received 2-wk catecholamine infusion. Results Cardiac contractility increased after 2d of isoproterenol in control, but not Mcu -cKO mice. Contractility declined and cardiac hypertrophy increased after 1-2-wk of isoproterenol in MCU-Tg mice. MCU-Tg cardiomyocytes displayed increased sensitivity to Ca 2+ - and isoproterenol-induced necrosis. However, loss of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) regulator cyclophilin D failed to attenuate contractile dysfunction and hypertrophic remodeling, and increased isoproterenol-induced cardiomyocyte death in MCU-Tg mice. Conclusions mtCU m Ca 2+ uptake is required for early contractile responses to adrenergic signaling, even those occurring over several days. Under sustained adrenergic load excessive MCU-dependent m Ca 2+ uptake drives cardiomyocyte dropout, perhaps independent of classical mitochondrial permeability transition pore opening, and compromises contractile function. These findings suggest divergent consequences for acute versus sustained m Ca 2+ loading, and support distinct functional roles for the mPTP in settings of acute m Ca 2+ overload versus persistent m Ca 2+ stress.