Summary Neuropils are compartments in the nervous system containing dense networks of neurites and synapses which function as information processing centers. Neuropil formation requires structural and functional organization at and across different scales, achieving single-axon precision for circuits that carry out the core functions while simultaneously accommodating variability among individuals [1; 2; 3; 4]. How these organizational features emerge over development is poorly understood. The nerve ring is the primary neuropil in C. elegans , and its structure is thoroughly mapped [5; 6]. We show that prior to axon outgrowth, nerve ring neurons form a ring of multicellular rosettes with surrounding cells to organize the stratified nerve ring structure [7; 8]. Axon bundles which correspond to future nerve ring strata grow from rosette centers, travel along the ring on “bridge” cells that are simultaneously engaged in adjacent rosettes, and assemble into a topographic scaffold of the nerve ring. SAX-3/Robo is required for proper rosette formation and outgrowth from the center. Furthermore, axon contact sites that form early in development are more conserved than the later ones, indicating a temporal component in neuropil structural variability. Our results reveal an unexpected and critical role of collective cell behaviors prior to innervation to pattern a complex neuropil and orchestrate its formation across scales.

Neuropil is a fundamental form of tissue organization within brains. In neuropils, densely packed neurons synaptically interconnect into precise circuit architecture, yet the structural and developmental principles governing nanoscale precision in bundled neuropil assembly remain largely unknown. Here we use diffusion condensation, a coarse-graining clustering algorithm, to identify nested circuit structures within the C. elegans cerebral neuropil (called the nerve ring). We determine that the nerve ring neuropil is organized into four tightly bundled strata composed of related behavioral circuits. We demonstrate that the stratified architecture of the neuropil is a geometrical representation of the functional segregation of sensory information and motor outputs, with specific sensory organs and muscle quadrants mapping onto particular neuropil strata. We identify groups of neurons with unique morphologies that integrate information across strata and that create a sophisticated honeycomb-shaped scaffold that encases the strata within the nerve ring. We resolve the developmental sequence leading to stratified neuropil organization through the integration of lineaging and cell tracking algorithms with high resolution light-sheet microscopy, and reveal principles of cell position, migration and hierarchical outgrowth that guide neuropil organization. Our results uncover conserved design principles underlying nerve ring neuropil architecture and function, and a pioneer neuron-based, temporal progression of outgrowth that guides the hierarchical development of the layered neuropil. Our findings provide a blueprint for using structural and developmental approaches to systematically understand neuropil organization within brains.

Abstract During development, neurites and synapses segregate into specific neighborhoods or layers within nerve bundles. The developmental programs guiding placement of neurites in specific layers, and hence their incorporation into specific circuits, are not well understood. We implement novel imaging methods and quantitative models to document the embryonic development of the C. elegans brain neuropil, and discover that differential adhesion mechanisms control precise placement of single neurites onto specific layers. Differential adhesion is orchestrated via developmentally-regulated expression of the IgCAM SYG-1, and its partner ligand SYG-2. Changes in SYG-1 expression across neuropil layers result in changes in adhesive forces, which sort SYG-2-expressing neurons. Sorting to layers occurs, not via outgrowth from the neurite tip, but via an alternate mechanism of retrograde zippering, involving interactions between neurite shafts. Our study indicates that biophysical principles from differential adhesion govern neurite placement and synaptic specificity in vivo in developing neuropil bundles.

Motivation: Cell shapes provide crucial biology information on complex tissues. Different cell types often have distinct cell shapes, and collective shape changes usually indicate morphogenetic events and mechanisms. The identification and detection of collective cell shape changes in an extensive collection of 3D time-lapse images of complex tissues is an important step in assaying such mechanisms but is a tedious and time-consuming task. Machine learning provides new opportunities to automatically detect cell shape changes. However, it is challenging to generate sufficient training samples for pattern identification through deep learning because of a limited amount of images and annotations. Result: We present a deep learning approach with minimal well-annotated training samples and apply it to identify multicellular rosettes from 3D live images of the Caenorhabditis elegans embryo with fluorescently labelled cell membranes. Our strategy is to combine two approaches, namely, feature transfer and generative adversarial networks (GANs), to boost image classification with small training samples. Specifically, we use a GAN framework and conduct an unsupervised training to capture the general characteristics of cell membrane images with 11,250 unlabelled images. We then transfer the structure of the GAN discriminator into a new Alex-style neural network for further learning with several dozen labelled samples. Our experiments showed that with 10-15 well-labelled rosette images and 30-40 randomly selected non-rosette images our approach can identify rosettes with over 80% accuracy and capture over 90% of the model accuracy achieved with a training dataset that is five times larger. We also established a public benchmark dataset for rosette detection. This GAN-based transfer approach can be applied to study other cellular structures with minimal training samples.

Coordination of neurite morphogenesis with surrounding tissues is crucial to the establishment of neural circuits, but the underlying cellular and molecular mechanisms remain poorly understood. We show that neurons in a C. elegans sensory organ, called the amphid, undergo a collective dendrite extension to initiate formation of the sensory nerve. The amphid neurons first assemble into a multicellular rosette. The vertex of the rosette, which becomes the dendrite tips, is attached to the anteriorly migrating epidermis and carried to the sensory depression, extruding the dendrites away from the neuronal cell bodies. Multiple adhesion molecules including DYF-7, SAX-7, HMR-1 and DLG-1 function redundantly in rosette-to-epidermis attachment. PAR-6 is localized to the rosette vertex and dendrite tips, and promotes DYF-7 localization and dendrite extension. Our results suggest a collective mechanism of neurite extension that is distinct from the classical pioneer-follower model and highlight the role of mechanical cues from surrounding tissues in shaping neurites.

In multicellular organisms, a single zygote develops along divergent lineages to produce distinct cell types. What governs these processes is central to the understanding of cell fate specification and stem cell engineering. Here we used the protochordate model Ciona savignyi to determine gene expression profiles of every cell of single embryos from fertilization through the onset of gastrulation and provided a comprehensive map of chordate early embryonic lineage specification. We identified 47 cell types across 8 developmental stages up to the 110-cell stage in wild type embryos and 8 fate transformations at the 64-cell stage upon FGF-MAPK inhibition. The identities of all cell types were evidenced by in situ expression pattern of marker genes and expected number of cells based on the invariant lineage. We found that, for the majority of asymmetrical cell divisions, the bipotent mother cell shows predominantly the gene signature of one of the daughter fates, with the other daughter being induced by subsequent signaling. Our data further indicated that the asymmetric segregation of mitochondria in some of these divisions does not depend on the concurrent fate inducing FGF-MAPK signaling. In the notochord, which is an evolutionary novelty of chordates, the convergence of cell fate from two disparate lineages revealed modular structure in the gene regulatory network beyond the known master regulator T/Brachyury. Comparison to single cell transcriptomes of the early mouse embryo showed a clear match of cell types at the tissue level and supported the hypothesis of developmental-genetic toolkit. This study provides a high-resolution single cell dataset to understand chordate embryogenesis and the relationship between fate trajectories and the cell lineage.

Abstract Analyses across imaging modalities allow the integration of complementary spatiotemporal information about brain development, structure and function. However, systematic atlasing across modalities is limited by challenges to effective image alignment. We combine highly spatially resolved electron microscopy (EM) and highly temporally resolved time-lapse fluorescence microscopy (FM) to examine the emergence of a complex nervous system in C. elegans embryogenesis. We generate an EM pseudo time series at four classic developmental stages and create a landmark-based co-optimization algorithm for cross-modality image alignment, which handles developmental heterochrony among datasets to achieve accurate single-cell level alignment. Synthesis based on the EM series and time-lapse FM series carrying different cell-specific markers reveals critical dynamic behaviors across scales of identifiable individual cells in the emergence of the primary neuropil, the nerve ring, as well as a major sensory organ, the amphid. Our study paves the way for systematic cross-modality analysis in C. elegans and demonstrates a powerful approach that may be applied broadly. Highlights An EM time series to examine the emergence of an entire nervous system A landmark-based co-optimization algorithm for cross modality image alignment in the presence of developmental heterochrony Integration of EM and fluorescence series reveals cell behaviors at high spatial and temporal resolution Systematic single-cell annotation of EM data enables efficient navigation and targeted re-imaging

SUMMARY Sequential rosettes are a type of collective cell behavior recently discovered in the C. elegans embryo to mediate directional cell migration through sequential formation and resolution of multicellular rosettes involving the migrating cell and its neighboring cells along the way. Here we show that a Planar Cell Polarity (PCP)-related polarity scheme regulates sequential rosettes, which is distinct from the known mode of how PCP regulates multicellular rosettes in the process of convergent extension. Specifically, non-muscle myosin (NMY) localization and edge contraction are perpendicular to that of Van Gogh as opposed to colocalizing with Van Gogh. Further analyses suggest a two-component polarity scheme: one being the canonical PCP pathway with MIG-1/Frizzled and VANG-1/Van Gogh localized to the vertical edges, the other being MIG-1/Frizzled and NMY-2 localized to the midline/contracting edges. Both MIG-1/Frizzled and VANG-1/Van Gogh are required for NMY-2 localization and contraction of the midline edges, but in redundancy with LAT-1/Latrophilin, an adhesion GPCR which has not been shown to regulate multicellular rosettes. Our results establish a distinct mode of PCP-mediated cell intercalation and shed light on the versatile nature of PCP pathway.

ABSTRACT Morphogenesis involves coordinated cell migrations and cell shape changes that generate tissues and organs, and organize the body plan. Cell adhesion and the cytoskeleton are important for executing morphogenesis, but their regulation remains poorly understood. As genes required for embryonic morphogenesis may have earlier roles in development, temperature-sensitive embryonic-lethal mutations are useful tools for investigating this process. From a collection of ∼200 such Caenorhabditis elegans mutants, we have identified 17 that have highly penetrant embryonic morphogenesis defects after upshifts from the permissive to the restrictive temperature, just prior to the cell shape changes that mediate elongation of the ovoid embryo into a vermiform larva. Using whole genome sequencing, we identified the causal mutations in seven affected genes. These include three genes that have roles in producing the extracellular matrix, which is known to affect the morphogenesis of epithelial tissues in multicellular organisms. The rib-1 and rib-2 genes encode glycosyltransferases, and the emb-9 gene encodes a collagen subunit. We also used live imaging to characterize epidermal cell shape dynamics in one mutant, or1219 ts, and observed cell elongation defects during dorsal intercalation and ventral enclosure that may be responsible for the body elongation defects. These results indicate that our screen has identified factors that influence morphogenesis and provides a platform for advancing our understanding of this fundamental biological process. SUMMARY We performed a systematic, forward genetics screen for temperature-sensitive embryonic-lethal (TS-EL) Caenorhabditis elegans mutants that are specifically defective in embryonic morphogenesis. By taking advantage of temperature-upshifts, we identified several essential genes influencing morphogenesis. We also demonstrated that one mutant has defects in epidermal cell shape changes that likely account for the failure in morphogenesis. The TS-EL mutants we identified will be useful tools for advancing our understanding of the gene networks controlling cell shape changes and movements during morphogenesis.

Immune cells live intensely physical lifestyles characterized by structural plasticity, mechanosensitivity, and force exertion. Whether specific immune functions require stereotyped patterns of mechanical output, however, is largely unknown. To address this question, we used super-resolution traction force microscopy to compare cytotoxic T cell immune synapses with contacts formed by other T cell subsets and macrophages. T cell synapses were globally and locally protrusive, which was fundamentally different from the coupled pinching and pulling of macrophage phagocytosis. By spectrally decomposing the force exertion patterns of each cell type, we associated cytotoxicity with compressive strength, local protrusiveness, and the induction of complex, asymmetric interfacial topographies. These features were further validated as cytotoxic drivers by genetic disruption of cytoskeletal regulators, direct imaging of synaptic secretory events, and in silico analysis of interfacial distortion. We conclude that T cell-mediated killing and, by implication, other effector responses are supported by specialized patterns of efferent force.