Abstract Mercury methylation genes ( hgcAB) mediate the formation of the toxic methylmercury and have been identified from diverse environments, including freshwater and marine ecosystems, Arctic permafrost, forest and paddy soils, coal-ash amended sediments, chlor-alkali plants discharges and geothermal springs. Here we present the first attempt at a standardized protocol for the detection, identification and quantification of hgc genes from metagenomes. Our Hg-MATE (Hg-cycling Microorganisms in Aquatic and Terrestrial Ecosystems) database, a catalogue of hgc genes, provides the most accurate information to date on the taxonomic identity and functional/metabolic attributes of microorganisms responsible for Hg methylation in the environment. Furthermore, we introduce “marky-coco”, a ready-to-use bioinformatic pipeline based on de novo single-metagenome assembly, for easy and accurate characterization of hgc genes from environmental samples. We compared the recovery of hgc genes from environmental metagenomes using the marky-coco pipeline with an approach based on co-assembly of multiple metagenomes. Our data show similar efficiency in both approaches for most environments except those with high diversity (i.e., paddy soils) for which a co-assembly approach was preferred. Finally, we discuss the definition of true hgc genes and methods to normalize hgc gene counts from metagenomes.

Abstract Bacteria have a profound impact on many key biogeochemical cycles in freshwater lake ecosystems; in turn, the composition of bacteria in the lake is contingent on the chemistry of the water. Many parameters that affect bacterial growth in freshwater ecosystems, such as water temperature, nutrient levels, and redox status, exhibit notable inter-annual differences in addition to seasonal changes. However, little is known about the impact of these inter- and intra-annual differences on the freshwater microbiome, especially in anoxic bottom waters. In this study, we paired biogeochemical field data with 16S rRNA gene amplicon sequencing of depth-discrete samples from a dimictic lake across two open-water seasons to observe variation in the microbiome relative to differences in water chemistry between two years. We found differences in the timing anoxia onset and the redox status in the water column across the two years. Changes in redox status led to major shifts in the microbial community composition. While there was little variation between years in the microbial taxonomic composition at the phyla level, there was substantial interannual variation at more resolved taxonomic levels. Some interannual differences can be explained by links between the predicted metabolic potential of those lineages and the different redox conditions between the two years. These results emphasize the need for repeated monitoring to deduce long-term trends in microbial communities in natural ecosystems and the importance of a comprehensive evaluation of environmental conditions contemporary with any microbiome analysis. Importance The results of this study add to the growing body of evidence that microbial communities in natural systems are temporally dynamic on multiple scales, and even more so at highly resolved taxonomic levels. By correlating our analysis of the microbial community with the redox status of the water column we find that many community differences between the years can be in part explained by these parameters. As collecting 16S rRNA data over many years is critical to understanding long term trends in microbial ecology, our study suggests that corresponding water chemistry data could be a powerful tool to help explain microbiome trends.

Abstract 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) is an herbicide commonly used in aquatic and terrestrial environments that is degraded by bacteria through the TFD pathway. Previous work has relied on culture-based methods to develop primers for qPCR analysis of the gene cassette in environmental samples. In this study, we combined molecular and genomic approaches to examine the accuracy of established tfdA qPCR primers on environmental samples and update the phylogeny of tfdA genes detected in bacterial genomes. We found most putative 2,4-D degraders are within the Proteobacteria but also found several novel degraders including members of the phyla Candidatus Rokubacteria and Candidatus Eremiobacteraeota. In silico analysis of established primers showed potential amplification of < 5% of putative degrader sequences but 52-100% of experimentally verified degraders when allowing for three and one mismatches between template and primer sequences, respectively. Overall, our work expands the diversity of putative 2,4-D degraders and demonstrates the limitations of culture-based tools for investigating functional diversity of microorganisms in the environment. Importance Cultivation-based methods can misrepresent the diversity of environmental microorganisms. Our work showcases one example of how culture-based development of molecular tools underestimates the full spectrum of 2,4-D degrading microorganisms. Accurately identifying microorganisms with 2,4-D degradation potential is crucial for understanding the biodegradation potential of a commonly used herbicide across terrestrial, aquatic, and subsurface environments. Additionally, this work reinforces well-documented pitfalls associated with relying on cultured representatives when constructing primers and the challenges of translating findings from a few cultured representatives to understudied or unknown microorganisms in complex environments.

Abstract Microbial biogeochemical cycling relies on alternative electron acceptors when oxygen is unavailable, yet the role of viruses (bacteriophages) in these processes is understudied. We investigated how seasonal anoxia impacts viral and microbial biogeochemical cycling, by using paired total metagenomes, viromes, and metatranscriptomes, that were collected weekly. Stratification and anoxia drove microbial community composition, but dataset origin impacted the interpretation of viral community structure, activity, and function. Importantly, taxa abundance did not correlate with activity for both microbes and viruses. We identified virus-host linkages for 116 phages across 55 distinct hosts, many of which expressed genes for aerobic methane oxidation, nitrogen fixation, denitrification, and sulfate reduction. Overall, this work demonstrates the breadth and dynamics of virus-host interactions in mediating biogeochemistry. Additionally, we propose that viral community detection, functional potential, and activity are sensitive to pre-sequencing decisions, which must be kept in mind when interpreting genomic data in a biologically meaningful way.

Methylmercury is a potent, bioaccumulating neurotoxin that is produced by specific microorganisms by methylation of inorganic mercury released from anthropogenic sources. The hgcAB genes were recently discovered to be required for microbial methylmercury production in diverse anaerobic bacteria and archaea. However, the full phylogenetic and metabolic diversity of mercury methylating microorganisms has not been fully explored due to the limited number of cultured, experimentally verified methylators and the limitations of primer-based molecular methods. Here, we describe the phylogenetic diversity and metabolic flexibility of putative mercury methylating microorganisms identified by hgcA sequence identity from publicly available isolate genomes and metagenome-assembled genomes (MAGs), as well as novel freshwater MAGs. We demonstrate that putative mercury methylators are much more phylogenetically diverse than previously known, and the distribution of hgcA is most likely due to several independent horizontal gene transfer events. Identified methylating microorganisms possess diverse metabolic capabilities spanning carbon fixation, sulfate reduction, nitrogen fixation, and metal resistance pathways. Using a metatranscriptomic survey of a thawing permafrost gradient from which we identified 111 putative mercury methylators, we demonstrate that specific methylating populations may contribute to hgcA expression at different depths. Overall, we provide a framework for illuminating the microbial basis of mercury methylation using genome-resolved metagenomics and metatranscriptomics to identify methylators based upon hgcA presence and describe their putative functions in the environment.

Mercury (Hg) methylation is a microbially mediated process that converts inorganic Hg into the bioaccumulative neurotoxin methylmercury (MeHg). Exploring the diversity and metabolic potential of the dominant Hg-methylating microorganisms can provide insights into how biogeochemical cycles and water quality parameters underlie MeHg production. However, our understanding of the ecophysiology of methylators in natural ecosystems is still limited. Here, we used shotgun metagenomics paired with biogeochemical data to identify likely hotspots for MeHg production in a lake with elevated sulfate levels and characterize the microbial methylators and the flanking microbial community. Identified putative methylators were dominated by hgcA sequences divergent from those in canonical, experimentally confirmed methylators. Using genome-resolved metagenomics, these sequences were identified within genomes associated with Bacteroidetes and the recently described phylum Kiritimatiellaeota. Over half of the hgcA abundance comes from genomes corresponding to obligately fermentative organisms, many of which have a large number of glucoside hydrolases for polysaccharide degradation. Sulfate-reducing genomes encoding hgcA were also identified, but only accounted for 22% of the abundance of hgcA+ genomes. This work highlights the diverse dispersal of the methylation trait across the microbial anoxic food web.