Abstract Tumor heterogeneity is predicted to confer inferior clinical outcomes, however modeling heterogeneity in a manner that still represents the tumor of origin remains a formidable challenge. Sequencing technologies are limited in their ability to identify rare subclonal populations and predict response to the multitude of available treatments for patients. Patient-derived organotypic cultures have significantly improved the modeling of cancer biology by faithfully representing the molecular features of primary malignant tissues. Patient-derived cancer organoid (PCO) cultures contain numerous individual organoids with the potential to recapitulate heterogeneity, though PCOs are most commonly studied in bulk ignoring any diversity in the molecular profile or treatment response. Here we demonstrate the advantage of evaluating individual PCOs in conjunction with cellular level optical metabolic imaging to characterize the largely ignored heterogeneity within these cultures to predict clinical therapeutic response, identify subclonal populations, and determine patient specific mechanisms of resistance.

Abstract Representative models are needed to screen new therapies for patients with cancer. Cancer organoids are a leap forward as a culture model that faithfully represents the disease. Mouse-derived cancer organoids (MDCOs) are becoming increasingly popular, however there has yet to be a standardized method to assess therapeutic response and identify subpopulation heterogeneity. There are multiple factors unique to organoid culture that could affect how therapeutic response and MDCO heterogeneity are assessed. Here we describe an analysis of nearly 3,500 individual MDCOs where individual organoid morphologic tracking was performed. Change in MDCO diameter was assessed in the presence of control media or targeted therapies. Individual organoid tracking was identified to be more sensitive to treatment response than well-level assessment. The impact of different generations of mice of the same genotype, different regions of the colon, and organoid specific characteristics including baseline size, passage number, plating density, and location within the matrix were examined. Only the starting size of the MDCO altered the subsequent growth. Here we establish organoid culture parameters for individual organoid morphologic tracking to determine therapeutic response and growth/response heterogeneity for translational studies using murine colorectal cancer organoids.

Summary Fibrolamellar carcinoma (FLC) is a rare and lethal cancer that afflicts young individuals. The tumor arises in the background of a healthy liver, and patients typically present with advanced cancer at the time of diagnosis. Unfortunately, for these patients with advanced or recurrent cancer, no proven systemic therapies exist resulting in only 30-45% of patients surviving to 5 years. Investigations into the molecular underpinning of FLC have revealed a unique gene fusion between heat shock protein 40 ( DNAJB1 ) and the catalytic subunit alpha of protein kinase A ( PRKACA ), leading to the formation of an oncoprotein (DNAJ-PKAc) that retains kinase activity and is a proven tumor-causing event in FLC. To uncover potential therapeutic targets, we engineered an FLC cell line by introducing the DNAJB1-PRKACA oncogene rearrangement into human hepatocellular cells using CRISPR/Cas9. We identified aberrant cell cycle progression, and follow-up molecular analysis revealed evidence of enhanced cyclin dependent kinase 7 (CDK7) activation in the DNAJB1-PRKACA expressing FLC cells. These findings were confirmed in human samples of FLC. In turn, targeting CDK7 with selective inhibitors demonstrated efficacy in several patient-derived models of FLC, with minimal toxicity to normal liver. Collectively, this work uncovers a novel candidate therapeutic vulnerability in FLC.