Abstract Genetic variants in SCN2A , encoding the Na V 1.2 voltage-gated sodium channel, are associated with a range of neurodevelopmental disorders with overlapping phenotypes. Some variants fit into a framework wherein gain-of-function missense variants that increase neuronal excitability lead to infantile epileptic encephalopathy, while loss-of-function variants that reduce neuronal excitability lead to developmental delay and/or autism spectrum disorder with or without co- morbid seizures. One unique case less easily classified using this binary paradigm is the de novo missense variant SCN2A p.K1422E, associated with infant-onset developmental delay, infantile spasms, and features of autism spectrum disorder. Prior structure-function studies demonstrated that K1422E substitution alters ion selectivity of Na V 1.2, conferring Ca 2+ permeability, lowering overall conductance, and conferring resistance to tetrodotoxin (TTX). Based on heterologous expression of K1422E, we developed a compartmental neuron model that predicted mixed effects on channel function and neuronal activity. We also generated Scn2a K1422E mice and characterized effects on neurons and neurological/neurobehavioral phenotypes. Dissociated neurons from heterozygous Scn2a K1422E/+ mice exhibited a novel TTX-resistant current with a reversal potential consistent with mixed ion permeation. Cortical slice recordings from Scn2a K1442E/+ tissue demonstrated impaired action potential initiation and larger Ca 2+ transients at the axon initial segment during the rising phase of the action potential, suggesting mixed effects on channel function. Scn2a K1422E/+ mice exhibited rare spontaneous seizures, interictal EEG abnormalities, altered response to induced seizures, reduced anxiety-like behavior and alterations in olfactory-guided social behavior. Overall, Scn2a K1422E/+ mice present with phenotypes similar yet distinct from Scn2a knockout models, consistent with mixed effects of K1422E on Na V 1.2 channel function. Significance Statement The early-onset epilepsy variant SCN2A -p.K1422E displays unique biophysical properties in vitro . To model the impact of this rare variant, we generated Scn2a K1422E mice. Neurons from heterozygous Scn2a K1422E/+ mice showed functional deficits similar to the loss-of-function effects observed in the Scn2a haploinsufficiency model, as well as gain-of-function effects specific to the K1422E variant. There is also some overlap in neurobehavioral phenotypes between Scn2a K1422E/+ and Scn2a haploinsufficient mice. However, Scn2a K1422E/+ mice exhibited unique epilepsy-related phenotypes, including epileptiform events and seizures. Scn2a K1422E/+ mice serve as a useful platform to investigate phenotypic complexity of SCN2A -associated disorders.

Pathogenic variants in

Pathogenic variants in SCN2A are associated with a range of neurodevelopmental disorders (NDD). Despite being largely monogenic, SCN2A -related NDD show considerable phenotypic variation and complex genotype-phenotype correlations. Genetic modifiers can contribute to variability in disease phenotypes associated with rare driver mutations. Accordingly, different genetic backgrounds across inbred rodent strains have been shown to influence disease-related phenotypes, including those associated with SCN2A-related NDD. Recently, we developed a mouse model of the variant SCN2A -p.K1422E that was maintained as an isogenic line on the C57BL/6J (B6) strain. Our initial characterization of NDD phenotypes in heterozygous Scn2a K1422E mice revealed alterations in anxiety-related behavior and seizure susceptibility. To determine if background strain affects phenotype severity in the Scn2a K1422E mouse model, phenotypes of mice on B6 and [DBA/2J x B6]F1 hybrid (F1D2) strains were compared. Convergent evidence from neurobehavioral assays demonstrated lower anxiety-like behavior in Scn2a K1422E mice compared to wild-type and further suggested that this effect is more pronounced on the B6 background compared to the F1D2 background. Although there were no strain-dependent differences in occurrence of rare spontaneous seizures, response to the chemoconvulsant kainic acid revealed differences in seizure generalization and lethality risk, with variation based on strain and sex. Continued examination of strain-dependent effects in the Scn2a K1422E mouse model could reveal genetic backgrounds with unique susceptibility profiles that would be relevant for future studies on specific traits and enable the identification of highly penetrant phenotypes and modifier genes that could provide clues about the primary pathogenic mechanism of the K1422E variant.

Pathogenic variants in KCNB1 , encoding the voltage-gated potassium channel KV2.1, are associated with developmental and epileptic encephalopathies (DEE). Previous functional studies on a limited number of KCNB1 variants indicated a range of molecular mechanisms by which variants affect channel function, including loss of voltage sensitivity, loss of ion selectivity, and reduced cell-surface expression. We evaluated a series of 17 KCNB1 variants associated with DEE or neurodevelopmental disorder (NDD) to rapidly ascertain channel dysfunction using high-throughput functional assays. Specifically, we investigated the biophysical properties and cell-surface expression of variant KV2.1 channels expressed in heterologous cells using high-throughput automated electrophysiology and immunocytochemistry-flow cytometry. Pathogenic variants exhibited diverse functional defects, including altered current density and shifts in the voltage-dependence of activation and/or inactivation, as homotetramers or when co-expressed with wild-type KV2.1. Quantification of protein expression also identified variants with reduced total KV2.1 expression or deficient cell-surface expression. Our study establishes a platform for rapid screening of functional defects of KCNB1 variants associated with DEE and other NDDs, which will aid in establishing KCNB1 variant pathogenicity and may enable discovery of targeted strategies for therapeutic intervention based on molecular phenotype.

Pathogenic variants in KCNB1 are associated with a neurodevelopmental disorder spectrum that includes global developmental delays, cognitive impairment, abnormal electroencephalogram (EEG) patterns, and epilepsy with variable age of onset and severity. Additionally, there are prominent behavioral disturbances, including hyperactivity, aggression, and features of autism spectrum disorder. The most frequently identified recurrent variant is KCNB1-p.R306C, a missense variant located within the S4 voltage-sensing transmembrane domain. Individuals with the R306C variant exhibit mild to severe developmental delays, behavioral disorders, and a diverse spectrum of seizures. Previous in vitro characterization of R306C described loss of voltage sensitivity and cooperativity of the sensor and inhibition of repetitive firing. Existing Kcnb1 mouse models include dominant negative missense variants, as well as knockout and frameshifts alleles. While all models recapitulate key features of KCNB1 encephalopathy, mice with dominant negative alleles were more severely affected. In contrast to existing loss-of-function and dominant-negative variants, KCNB1-p.R306C does not affect channel expression, but rather affects voltage-sensing. Thus, modeling R306C in mice provides a novel opportunity to explore impacts of a voltage-sensing mutation in Kcnb1. Using CRISPR/Cas9 genome editing, we generated the Kcnb1R306C mouse model and characterized the molecular and phenotypic effects. Heterozygous and homozygous R306C mice exhibited pronounced hyperactivity, altered susceptibility to flurothyl and kainic acid induced-seizures, and frequent, long runs of spike wave discharges on EEG. This novel model of channel dysfunction in Kcnb1 provides an additional, valuable tool to study KCNB1 encephalopathies. Furthermore, this allelic series of Kcnb1 mouse models will provide a unique platform to evaluate targeted therapies.