ABSTRACT Recent advancements in tissue clearing technologies have offered unparalleled opportunities for researchers to explore the whole mouse brain at cellular resolution. With the expansion of this experimental technique, however, a scalable and easy-to-use computational tool is in demand to effectively analyze and integrate whole-brain mapping datasets. To that end, here we present CUBIC-Cloud, a cloud-based framework to quantify, visualize and integrate whole mouse brain data. CUBIC-Cloud is a fully automated system where users can upload their whole-brain data, run analysis and publish the results. We demonstrate the generality of CUBIC-Cloud by a variety of applications. First, we investigated brain-wide distribution of PV, Sst, ChAT, Th and Iba1 expressing cells. Second, Aβ plaque deposition in AD model mouse brains were quantified. Third, we reconstructed neuronal activity profile under LPS-induced inflammation by c-Fos immunostaining. Last, we show brain-wide connectivity mapping by pseudo-typed Rabies virus. Together, CUBIC-Cloud provides an integrative platform to advance scalable and collaborative whole-brain mapping.

Abstract The homeostatic regulation of sleep is characterized by rebound sleep after prolonged wakefulness, but the molecular and cellular mechanisms underlying this regulation are still unknown. We show here that CaMKII-dependent activity control of parvalbumin (PV)-expressing cortical neurons is involved in sleep homeostasis regulation. Prolonged wakefulness enhances cortical PV-neuron activity. Chemogenetic suppression or activation of cortical PV neurons inhibits or induces rebound sleep, implying that rebound sleep is dependent on increased activity of cortical PV neurons. Furthermore, we discovered that CaMKII kinase activity boosts the activity of cortical PV neurons, and that kinase activity is important for homeostatic sleep rebound. We propose that CaMKII-dependent PV-neuron activity represents negative feedback inhibition of cortical neural excitability, which serves as the distributive cortical circuits for sleep homeostatic regulation.

Abstract Phosphorylation of synaptic proteins is a pivotal biochemical reaction that controls the sleep-wake cycle in mammals. Protein phosphorylation in vivo is reversibly regulated by kinases and phosphatases. In this study, we investigated a pair of kinases and phosphatases that reciprocally regulate sleep duration. Through comprehensive screening of Protein kinase A (PKA) and phosphoprotein phosphatase (PPP) family genes via the generation of 40 gene knockout mouse lines including post-natal CRISPR targeting, we identified a regulatory subunit of PKA ( Prkar2b ), a regulatory subunit of protein phosphatase (PP) 1 ( Pppr1r9b ), and catalytic and regulatory subunits of PP2B (calcineurin) ( Ppp3ca and Ppp3r1 ) as sleep control genes. AAV-mediated stimulation of PKA and PP1/calcineurin activities confirmed PKA as a wake-promoting kinase, while PP1 and calcineurin function as sleep-promoting phosphatases. The importance of these phosphatases in sleep regulation is supported by the dramatic changes in sleep duration associated with their increased and decreased activity, ranging from approximately 17.3 hours/day (PP1 expression) to 6.7 hours/day (post-natal CRISPR targeting of calcineurin). For these phosphatases to exert their sleep-promoting effects, localization signals to the excitatory post-synapse were necessary. Furthermore, the wake-promoting effect of PKA localized to the excitatory post-synapse negated the sleep-promoting effect of calcineurin, suggesting that PKA and calcineurin construct a hierarchical phosphorylation control network for sleep regulation at excitatory post-synapses.

Abstract The homeostatic regulation of sleep is characterized by rebound sleep after prolonged wakefulness, but the molecular and cellular mechanisms underlying this regulation are still unknown. In this study, we show that Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII)-dependent activity control of parvalbumin (PV)-expressing cortical neurons is involved in homeostatic regulation of sleep in male mice. Prolonged wakefulness enhances cortical PV-neuron activity. Chemogenetic suppression or activation of cortical PV neurons inhibits or induces rebound sleep, implying that rebound sleep is dependent on increased activity of cortical PV neurons. Furthermore, we discovered that CaMKII kinase activity boosts the activity of cortical PV neurons, and that kinase activity is important for homeostatic sleep rebound. Here, we propose that CaMKII-dependent PV-neuron activity represents negative feedback inhibition of cortical neural excitability, which serves as the distributive cortical circuits for sleep homeostatic regulation.

ABSTRACT The reduced sleep duration observed in Camk2a and Camk2b knockout mice revealed the role of Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII)α/CAMKIIβ as sleep-promoting kinases and lead to the phosphorylation hypothesis of sleep. However, the underlying mechanism of sleep regulation by kinases and protein phosphorylation is largely unknown. Here, we demonstrate that the phosphorylation states of CaMKIIβ regulates sleep duration and sleep needs. Importantly, the activation or inhibition of CaMKIIβ can increase or decrease sleep duration by almost two-fold, supporting the role of CaMKIIβ as a core sleep regulator in mammals. This sleep regulation depends on the kinase activity of CaMKIIβ in excitatory neurons. Furthermore, CaMKIIβ mutants mimicking different phosphorylation states can regulate various sleep steps including sleep induction, sleep maintenance, and sleep cancelation. Key CaMKIIβ residues responsible for the mode switch undergo ordered (auto-)phosphorylation. We thus propose that ordered multi-site phosphorylation of CaMKIIβ underlies multi-step sleep regulation in mammals.

Circadian rhythms, integral to physiological and behavioral processes, are influenced by environmental cues and developmental stages. This study explores the visualization and analysis of circadian rhythms through non-invasive monitoring of surface body temperature (STGram: Surface Thermo Deviations gram), focusing on the effects of jet lag in international travelers and the developmental progression of circadian rhythms in infants. Using a compact, wearable thermometric device, we collected data from adults experiencing jet lag and a 3-month-old infant over five months. Our analysis identified clear circadian shifts in travelers and illustrated the gradual establishment of circadian rhythms in the infant. These findings underscore the effectiveness of surface body temperature as a marker for circadian rhythm analysis, offering a valuable tool for understanding circadian dynamics and their impact on health. This methodological approach has significant implications for circadian rhythm research, health management, and the study of physiological development.

Sleep is regulated by homeostatic processes, yet the biological basis of sleep pressure that accumulates during wakefulness, triggers sleep, and dissipates during sleep remains elusive. We explored a causal relationship between cellular synaptic strength and electroencephalography delta power indicating macro-level sleep pressure by developing a theoretical framework and a molecular tool to manipulate synaptic strength. The mathematical model predicted that increased synaptic strength promotes the neuronal “down state” and raises the delta power. Our molecular tool (synapse-targeted chemically induced translocation of Kalirin-7, SYNCit-K), which induces dendritic spine enlargement and synaptic potentiation through chemically induced translocation of protein Kalirin-7, demonstrated that synaptic potentiation of excitatory neurons in the prefrontal cortex (PFC) increases nonrapid eye movement sleep amounts and delta power. Thus, synaptic strength of PFC excitatory neurons dictates sleep pressure in mammals.

Abstract Tremendous effort has focused on determining the physical connectivity within the mouse brain. However, the strength of connections within the brain constantly changes throughout the 24-hour day. Here, we combine experimental and computational methods to determine an “active connectivity” of the physical connections between the most active neurons. Brain cells of freely behaving mice are genetically marked with the activity- dependent TRAP2 system, imaged, digitized, and their connectivity is inferred from the latest brain atlases. We apply our methods to determine the most active networks in the early light and early dark hours of the day, two periods with distinct differences in sleep, wake, and feeding behavior. Increased signaling is seen through the visceral and agranular insular (AI) regions in the early day as peripheral stimuli are integrated. On the other hand, there is an increase in the activity of the retrosplenial cortex (RSP) and the anterior cingulate cortex (ACC) during the early night, when more sustained attention is required. Our framework carves a window to the three-dimensional networks of active connections in the mouse brain that underlie spontaneous behaviors or responses to environmental changes, thus providing the basis for direct computer simulations and analysis of such networks in the future.