Abstract Background Over the last ten years, the discovery and FDA approval of targeted therapies for lung cancer has significantly improved patient survival rates. However, despite these improved survival rates, only 68% of patients receive molecular testing that results in assignment of targeted therapy 1,2 . Barriers to timely access to biomarker information include no testing ordered 3 ,high nucleic acid input requirements, and problematic turnaround time (TAT) by NGS (> 14 days) 4 . Here we report the analytical performance and concordance with next-generation sequencing (NGS) of a highly-multiplexed research use only (RUO) panel using digital PCR (dPCR). The HDPCR NSCLC panel reports the status for variants (SNV, indels, and fusions) in eight actionable genes using amplitude modulation and multi-spectral encoding in dPCR 5 . Methods The panel’s analytical sensitivity and reactivity were determined using DNA and RNA extracted from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue spiked with plasmid DNA or in-vitro transcribed RNA. Concordance was established on 106 FFPE samples previously characterized using the Oncomine Precision Assay® or pathology results. Discordant resolution was resolved with Archer Fusionplex® and Variantplex® panels. Results The analytical sensitivity, reported as estimated mutant allele fraction (MAF), for DNA targets ( EGFR exon 19 deletions, EGFR exon 20 insertions, EGFR S768I, EGFR L858R, EGFR T790M, EGFR L861Q, BRAF V600E, EGFR G719X, ERBB2 exon 20 insertions and KRAS G12C) ranged from 0.8% – 4.9% with 40 ng of DNA input, and 2.4% to 10.9% with 15 ng of DNA input. For RNA fusion targets ( ALK, RET, ROS, NTRK 1/2/3, and MET exon 14 skipping), the analytical sensitivity ranged from 24 - 150 copies with 5 ng of total RNA input. The population prevalence-based coverage ranged from 89.2% to 100.0% across targets and >99.0% in aggregate. The accuracy of the assay was >97% with respect to the comparator method.

Abstract Digital PCR (dPCR) is emerging as an ideal platform for the detection and tracking of genomic variants in cancer due to its high sensitivity and simple workflow. The growing number of clinically-actionable cancer biomarkers creates a need for fast, accessible methods that allow for dense information content and high accuracy. Here, we describe a proof-of-concept amplitude modulation based multiplex dPCR assay capable of detecting 12 single nucleotide and indel variants in EGFR , KRAS , BRAF , and ERBB2, 14 gene fusions in ALK, RET, ROS1, NTRK1, and MET exon 14 skipping present in non-small cell lung cancer (NSCLC). We also demonstrate the use of multi-spectral target signal encoding to improve the specificity of variant detection by reducing background noise up to 11-fold. The assay reported an overall 100% PPA and 98.5% NPA compared to a sequencing-based assay in a cohort of 62 human FFPE samples. In addition, the dPCR assay rescued actionable information in 10 samples that failed to sequence, highlighting the utility of a multiplexed digital assay as a potential reflex solution for challenging NSCLC samples.

Abstract Digital PCR (dPCR) is the gold standard analytical platform for rapid high precision quantification of genomic fragments. However, current dPCR assays are generally limited to monitoring 1-2 analytes per sample, thereby limiting the platform’s ability to address some clinical applications that require the simultaneous monitoring of 20 – 50 analytes per sample. Here we present Virtual Partition dPCR (VPdPCR), a novel analysis methodology enabling the detection of 10 or more target regions per color channel using conventional dPCR hardware and workflow. Furthermore, VPdPCR enables dPCR instruments to overcome upper quantitation limits caused by partitioning error. While traditional dPCR analysis establishes a single threshold to separate negative and positive partitions, VPdPCR establishes multiple thresholds to identify the number of unique targets present in each positive droplet based on fluorescent intensity. Each physical partition is then divided into a series of virtual partitions, and the resulting increase in partition count substantially decreases partitioning error. We present both a theoretical analysis of the advantages of VPdPCR and an experimental demonstration in the form of a 20-plex assay for non-invasive fetal aneuploidy testing. This demonstration assay – tested on 432 samples contrived from sheared cell-line DNA at multiple input concentrations and simulated fractions of euploid or trisomy-21 “fetal” DNA – is analyzed using both traditional dPCR thresholding and VPdPCR. VPdPCR analysis significantly lowers variance of chromosome ratio across replicates and increases the accuracy of trisomy identification when compared to traditional dPCR, yielding > 98% single-well sensitivity and specificity. VPdPCR has substantial promise for increasing the utility of dPCR in applications requiring ultra-high-precision quantitation.