ABSTRACT Background The renin-angiotensin system involves many more enzymes, receptors and biologically active peptides than originally thought. With this study, we investigated whether angiotensin-(1-5) [Ang-(1-5)], a 5-amino acid fragment of angiotensin II, has biological activity, and through which receptor it elicits effects. Methods The effect of Ang-(1-5) (1µM) on nitric oxide release was measured by DAF-FM staining in human aortic endothelial cells (HAEC), or Chinese Hamster Ovary (CHO) cells stably transfected with the angiotensin AT 2 -receptor (AT 2 R) or the receptor Mas. A potential vasodilatory effect of Ang-(1-5) was tested in mouse mesenteric and human renal arteries by wire myography; the effect on blood pressure was evaluated in normotensive C57BL/6 mice by Millar catheter. These experiments were performed in the presence or absence of a range of antagonists or inhibitors or in AT 2 R-knockout mice. Binding of Ang-(1-5) to the AT 2 R was confirmed and the preferred conformations determined by in silico docking simulations. The signaling network of Ang-(1-5) was mapped by quantitative phosphoproteomics. Results Key findings included: (1) Ang-(1-5) induced activation of eNOS by changes in phosphorylation at Ser1177 eNOS and Tyr657 eNOS and thereby (2) increased NO release from HAEC and AT 2 R-transfected CHO cells, but not from Mas-transfected or non-transfected CHO cells. (3) Ang-(1-5) induced relaxation of preconstricted mouse mesenteric and human renal arteries and (4) lowered blood pressure in normotensive mice – effects which were respectively absent in arteries from AT 2 R-KO or in PD123319-treated mice and which were more potent than effects of the established AT 2 R-agonist C21. (5) According to in silico modelling, Ang-(1-5) binds to the AT 2 R in two preferred conformations, one differing substantially from where the first five amino acids within angiotensin II bind to the AT 2 R. (6) Ang-(1-5) modifies signaling pathways in a protective RAS-typical way and with relevance for endothelial cell physiology and disease. Conclusions Ang-(1-5) is a potent, endogenous AT 2 R-agonist.

Abstract The RNA exosome is a versatile ribonuclease. In the nucleoplasm of mammalian cells, it is assisted by its adaptors the Nuclear EXosome Targeting (NEXT) complex and the PolyA eXosome Targeting (PAXT) connection. Via its association with the ARS2 and ZC3H18 proteins, NEXT/exosome is recruited to capped and short unadenylated transcripts. Conversely, PAXT/exosome was considered to target longer and adenylated substrates via their poly(A) tails. Here, mutational analysis of the core PAXT component ZFC3H1 uncovers a separate branch of the PAXT pathway, which targets short adenylated RNAs and relies on a direct ARS2-ZFC3H1 interaction. We further demonstrate that similar acidic-rich short linear motifs of ZFC3H1 and ZC3H18 compete for a common ARS2 epitope. Consequently, while promoting NEXT function, ZC3H18 antagonizes PAXT activity. We suggest that this unprecedented organization of RNA decay complexes provides co-activation of NEXT and PAXT at loci with abundant production of short exosome substrates.

Abstract Neural organoids are invaluable model systems for studying neurodevelopment and neurological diseases. For this purpose, reproducible differentiation protocols are needed that minimize inter-organoid variability whilst generating neural organoids that physiologically resemble the brain area of interest. Currently, two main approaches are used: guided, where the differentiation towards neuroectoderm and subsequently specific CNS regions is driven by applying extrinsic signalling molecules, and unguided, where the intrinsic capability of pluripotent stem cells to generate neuroectoderm without external signalling is promoted. Despite the importance for the field, the resulting differences between these models have not been directly investigated. To obtain an unbiased comparison, we performed a multi-omic analysis of forebrain organoids generated using a guided and unguided approach focusing on proteomic, lipidomic and metabolomic differences. Furthermore, we characterised differences in phosphorylation and sialylation states of proteins, two key post-translational modifications (PTMs) in neurodevelopment, and performed single cell transcriptomics (scRNAseq). The multi-omic analysis revealed considerable differences in neuronal-, synaptic and glial content, indicating that guided forebrain organoids contain a larger proportion of neurons, including GABAergic interneurons, and synapses whereas unguided organoids contain significantly more GFAP + cells and choroid plexus. Furthermore, substantial differences in mitochondrial- and metabolic profiles were identified, pointing to increased levels of oxidative phosphorylation and fatty acid β-oxidation in unguided forebrain organoids and a higher reliance on glycolysis in guided forebrain organoids. Overall, our study comprises a thorough description of the multi-omic differences arising when generating guided and unguided forebrain organoids and provide an important resource for the organoid field studying neurodevelopment and -disease.

Cerebral organoids (CBOs) are generated from pluripotent stem cells that undergo neuroectoderm specification and neuronal differentiation in three dimensions. The developing neurons in CBOs migrate and self-organize into cerebral cortex-like layers, mimicking human brain development. CBOs develop according to intrinsic signaling mechanisms and offer unique insights into mechanisms of early human brain development. This process requires coordinated spatiotemporal regulation of protein expression and function, where the latter can be achieved by post-translational modifications (PTMs) on proteins. Despite the importance of proteins in brain development and function, profiling of protein abundance and the involvement of PTMs in CBO development remain underexplored. To gain insight into protein and PTM abundance in CBOs, we performed a high-resolution temporal analysis of CBOs up to day 200 using proteomics, PTMomics and metabolomics. We quantified more than 9,300 proteins and various neurodevelopmentally relevant PTMs (including phosphorylation, lysine acetylation, sialylated N-glycosylation, and cysteine modifications). We demonstrate that protein abundance and dynamic PTMs show significant temporal changes during CBO development related to neuronal differentiation and energy metabolism, whereas calcium signaling is mainly regulated by dynamic PTMs. We further show that synaptic protein content correlated with neurotransmitter levels, and we detected astroglia beyond day 100. Lastly, comparative analysis showed proteomic similarities between CBOs and human fetal brain tissue, supporting the physiological relevance of CBOs. Overall, our study presents a temporal atlas of protein and PTM abundance in CBOs and provides a valuable resource for studying neurodevelopment in neural organoids.