ABSTRACT ISG15 is an interferon-stimulated, ubiquitin-like protein that can conjugate to substrate proteins (ISGylation) to counteract microbial infection, but the underlying mechanisms remain elusive. Here, we used a viral-like particle trapping technology to identify ISG15-binding proteins and discovered Ring Finger Protein 213 (RNF213) as an ISG15 interactor and cellular sensor of ISGylated proteins. RNF213 is a poorly-characterized, interferon-induced megaprotein that is frequently mutated in Moyamoya disease, a rare cerebrovascular disorder. We found that interferon induces ISGylation and oligomerization of RNF213 on lipid droplets, where it acts as a sensor for ISGylated proteins. We showed that RNF213 has broad antimicrobial activity in vitro and in vivo, counteracting infection with Listeria monocytogenes, herpes simplex virus 1 (HSV-1), human respiratory syncytial virus (RSV) and coxsackievirus B3 (CVB3), and we observed a striking co-localization of RNF213 with intracellular bacteria. Together, our findings provide novel molecular insights into the ISGylation pathway and reveal RNF213 as a key antimicrobial effector.

Abstract The hypothalamus plays a vital role in coordinating essential neuroendocrine, autonomic, and somatomotor responses for survival and reproduction. While previous studies have explored population-level projections of hypothalamic neurons, the specific innervation patterns of individual hypothalamic axons remain unclear. To understand the organization of hypothalamic axon projections, we conducted a comprehensive reconstruction of single-cell projectomes from 7,180 mouse hypothalamic neurons expressing specific neuropeptides. Our analysis identified 31 distinct subtypes based on projectome-defined characteristics, with many exhibiting long-range axon collateral projections to multiple brain regions. Notably, these subtypes selectively targeted specific subdomains within downstream areas, either unilaterally or bilaterally. Furthermore, we observed that individual peptidergic neuronal types encompassed multiple projectome-defined subtypes, explaining their diverse functional roles. Additionally, by examining intra-hypothalamic axon projections, we uncovered six modular subnetworks characterized by enriched intramodular connections and distinct preferences for downstream targets. This modular organization of the intra-hypothalamic network likely contributes to the coordinated organization of hypothalamic outputs. In summary, our comprehensive projectome analysis reveals the organizational principles governing hypothalamic axon projections, providing a framework for understanding the neural circuit mechanisms underlying the diverse and coordinated functions of the hypothalamus.

Abstract Wastewater treatment plants (WWTPs) are the hotspots for the spread of antibiotic resistance genes (ARGs) into the environment. Nevertheless, a comprehensive assessment of the city-level and short-term daily variations of ARG surveillance is still lacking in WWTPs. Here, 285 ARGs and ten mobile gene elements (MGEs) were monitored in seven WWTPs in Xiamen via high-throughput qPCR (HT-qPCR) for seven days. The average daily load of ARGs to WWTPs was about 1.21 × 10 20 copies/d, and a total of 1.44 × 10 18 copies/d was discharged to the environment across the entire city. Interestingly, no daily variations were observed in ARG richness, abundance, and community composition. Stochastic processes were the main force determining the assembly of ARG communities, with their relative importance ranked in the order of influent (INF) > effluent (EFF) > activated sludge (AS). Further analyses indicated that bacteria and ARGs from upstream treatment units played an increasingly dominant role in shaping ARG communities in AS and EFF, respectively, suggesting the importance of mass-immigration of bacteria and ARGs from the source on ARG transport in wastewater treatment units. This emphasizes the need to revise the way we mitigate ARG contamination but focus on the source of ARGs in urban wastewater.

The Interferon-Stimulated Gene 15 (ISG15) is a ubiquitin-like protein induced by viral and bacterial infection. ISG15 covalently modifies host and pathogenic proteins in a process called ISGylation. Yet, the consequences of ISGylation on protein fate and function remain to be determined. Here we sought to assess whether ISGylation would be protective following bacterial pneumonia caused by Francisella novicida. We found that infection with F. novicida induces ISGylation both in vitro in macrophages and in vivo in the lung, liver, and spleen of mice infected intranasally. Surprisingly, ISG15 and ISGylation do not affect bacterial burden in the lung in vivo, but in a model of enhanced ISGylation (usp18C61A/C61A) mice have decreased respiratory distress relative to Isg15-/-animals. In order to understand the mechanism which underlies this phenotype, we mapped the ISGylome of F. novicida-infected mouse lungs using label-free quantitative mass spectrometry and identified enrichment in ISGylation of proteins involved in the innate immune response and cytosolic nucleotide signaling. We validated ISGylation of the sterile alpha motif and HD-containing protein 1 (SAMHD1) via immunoprecipitation. SAMHD1 depletes cytosolic dinucleotide stores critical for retroviral replication but it is unknown how its activity could affect bacterial infection. Structure-function analysis indicates that ISG15 modification sites in usp18C61A/C61A mice could prevent SAMHD1 dimerization and therefore abrogate function. Accordingly, deletion of SAMHD1 in fibroblasts with enhanced ISGylation reduces bacterial load. Taken together, unchecked ISGylation plays a protective role in F. novicida infection in vivo through improved respiratory function. Thus, inhibiting USP18 may be a promising therapeutic strategy for both viral and bacterial pneumonia.