CBASS is a common anti-phage immune system that uses cyclic oligonucleotide signals to activate effectors and limit phage replication. In turn, phages encode anti-CBASS (Acb) proteins. We recently uncovered a widespread phage anti-CBASS protein Acb2 that acts as a "sponge" by forming a hexamer complex with three cGAMP molecules. Here, we identified that Acb2 binds and sequesters many CBASS and cGAS-produced cyclic dinucleotides in vitro and inhibits cGAMP-mediated STING activity in human cells. Surprisingly, Acb2 also binds CBASS cyclic trinucleotides 3'3'3'-cyclic AMP-AMP-AMP (cA3) and 3'3'3'-cAAG with high affinity. Structural characterization identified a distinct binding pocket within the Acb2 hexamer that binds two cyclic trinucleotide molecules and another binding pocket that binds to cyclic dinucleotides. Binding in one pocket does not allosterically alter the other, such that one Acb2 hexamer can simultaneously bind two cyclic trinucleotides and three cyclic dinucleotides. Phage-encoded Acb2 provides protection from Type III-C CBASS that uses cA3 signaling molecules in vivo and blocks cA3-mediated activation of the endonuclease effector in vitro. Altogether, Acb2 sequesters nearly all known CBASS signaling molecules through two distinct binding pockets and therefore serves as a broad-spectrum inhibitor of cGAS-based immunity.

The inert chemical property of RNA modification N6-methyladenosine (m6A) makes it very challenging to detect, and all of the transcriptome-wide m6A detection methods rely on m6A-antibody immunoprecipitation. However, their results are dependent on the quality and specificity of antibodies. Although the endoribonuclease-based single-base m6A sequencing is antibody-free, it maps only 16~25% sites. Here, we present an antibody-free, FTO-assisted chemical labeling method termed m6A-SEAL for m6A detection. We applied m6A-SEAL to profile m6A landscapes in human and plant, which had good overlaps with antibody-based results and displayed the known m6A distribution features in transcriptome. Comparison with all available m6A sequencing methods and specific m6A sites validation by SELECT, we demonstrated that m6A-SEAL has good sensitivity, specificity, and reliability for transcriptome-wide detection of m6A. Given its tagging ability and FTO oxidation property, m6A-SEAL enables many applications like enrichment, imaging, and sequencing techniques to drive future functional studies of m6A and other modifications.

Prokaryotic anti-phage immune systems use TIR (toll/interleukin-1 receptor) and cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) enzymes to produce 199-39/199-29 glycocyclic ADPR (gcADPR) and cyclid di-/tri-nucleotides (CDNs and CTNs) signaling molecules that limit phage replication, respectively. However, how phages neutralize these common systems is largely unknown. Here, we show that Thoeris anti-defense proteins Tad1 and Tad2 both have anti-CBASS activity by simultaneously sequestering CBASS cyclic oligonucleotides. Strikingly, apart from binding Thoeris signals 199-39 and 199-29 gcADPR, Tad1 also binds numerous CBASS CDNs/CTNs with high affinity, inhibiting CBASS systems using these molecules in vivo and in vitro. The hexameric Tad1 has six binding sites for CDNs or gcADPR, which are independent from two high affinity binding sites for CTNs. Tad2 also sequesters various CDNs in addition to gcADPR molecules, inhibiting CBASS systems using these CDNs. However, the binding pockets for CDNs and gcADPR are different in Tad2, whereby a tetramer can bind two CDNs and two gcADPR molecules simultaneously. Taken together, Tad1 and Tad2 are both two-pronged inhibitors that, alongside anti-CBASS protein 2, establish a paradigm of phage proteins that flexibly sequester a remarkable breadth of cyclic nucleotides involved in TIR- and cGAS-based anti-phage immunity.