Correct wiring is crucial for the proper functioning of the nervous system. Molecular gradients provide critical signals to guide growth cones, which are the motile tips of developing axons, to their targets. However, in vitro, growth cones trace highly stochastic trajectories, and exactly how molecular gradients bias their movement is unclear. Here, we introduce a mathematical model based on persistence, bias, and noise to describe this behaviour, constrained directly by measurements of the detailed statistics of growth cone movements in both attractive and repulsive gradients in a microfluidic device. This model provides a mathematical explanation for why average axon turning angles in gradients in vitro saturate very rapidly with time at relatively small values. This work introduces the most accurate predictive model of growth cone trajectories to date, and deepens our understanding of axon guidance events both in vitro and in vivo.

The mechanical properties of the extracellular matrix (ECM) can exert significant influence in determining cell fate. Human mesenchymal stem cells (MSCs) grown on substrates with varying stiffness have been shown to express various cell lineage markers, without the use of toxic DNA demethylation agents or complex cocktails of expensive growth factors. Here we investigated the myogenic and osteogenic potential of various polyacrylamide gel substrates that were coated with covalently bound tissue-specific ECM proteins (collagen I, collagen IV, laminin, or fibronectin). The gel-protein substrates were shown to support the growth and proliferation of MSCs in a stiffness-dependent manner. Higher stiffness substrates encouraged up to a 10-fold increase in cell number over lower stiffness gels. There appears to be definitive interplay between substrate stiffness and ECM protein with regard to the expression of both osteogenic and myogenic transcription factors by MSCs. Of the 16 gel-protein combinations investigated, osteogenic differentiation was found to occur significantly only on collagen I-coated gels with the highest modulus gel tested (80 kPa). Myogenic differentiation occurred on all gel-protein combinations that had stiffnesses >9 kPa but to varying extents as ascertained by MyoD1 expression. Peak MyoD1 expression was seen on gels with a modulus of 25 kPa coated in fibronectin, with similar levels of expression observed on 80-kPa collagen I-coated gels. The modulation of myogenic and osteogenic transcription factors by various ECM proteins demonstrates that substrate stiffness alone does not direct stem cell lineage specification. This has important implications in the development of tailored biomaterial systems that more closely mimic the microenvironment found in native tissues.

While biodegradable, biocompatible polyesters such as poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) are popular materials for the manufacture of tissue engineering scaffolds, their surface properties are not particularly suitable for directed tissue growth. Although a number of approaches to chemically modify the PLGA surface have been reported, their applicability to soft tissue scaffolds, which combine large volumes, complex shapes, and extremely fine structures, is questionable. In this paper, we describe two wet-chemical methods, base hydrolysis and aminolysis, to introduce useful levels of carboxylic acid or primary and secondary amine groups, respectively, onto the surface of PLGA with minimal degradation. The effects of temperature, concentration, pH, and solvent type on the kinetics of these reactions are studied by following changes in the wettability of the PLGA using contact angle measurements. In addition, the treated surfaces are studied using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) to determine the effect on the surface chemical structure. Furthermore, we show using XPS analysis that these carboxyl and amine groups are readily activated to allow the covalent attachment of biological macromolecules.

The dynamics of drop formation and pinch-off have been investigated for a series of low viscosity elastic fluids possessing similar shear viscosities, but differing substantially in elastic properties. On initial approach to the pinch region, the viscoelastic fluids all exhibit the same global necking behavior that is observed for a Newtonian fluid of equivalent shear viscosity. For these low viscosity dilute polymer solutions, inertial and capillary forces form the dominant balance in this potential flow regime, with the viscous force being negligible. The approach to the pinch point, which corresponds to the point of rupture for a Newtonian fluid, is extremely rapid in such solutions, with the sudden increase in curvature producing very large extension rates at this location. In this region the polymer molecules are significantly extended, causing a localized increase in the elastic stresses, which grow to balance the capillary pressure. This prevents the necked fluid from breaking off, as would occur in the equivalent Newtonian fluid. Alternatively, a cylindrical filament forms in which elastic stresses and capillary pressure balance, and the radius decreases exponentially with time. A (0+1)-dimensional finitely extensible nonlinear elastic dumbbell theory incorporating inertial, capillary, and elastic stresses is able to capture the basic features of the experimental observations. Before the critical “pinch time” tp, an inertial-capillary balance leads to the expected 2∕3-power scaling of the minimum radius with time: Rmin∼(tp−t)2∕3. However, the diverging deformation rate results in large molecular deformations and rapid crossover to an elastocapillary balance for times t>tp. In this region, the filament radius decreases exponentially with time Rmin∼exp[(tp−t)∕λ1], where λ1 is the characteristic time constant of the polymer molecules. Measurements of the relaxation times of polyethylene oxide solutions of varying concentrations and molecular weights obtained from high speed imaging of the rate of change of filament radius are significantly higher than the relaxation times estimated from Rouse-Zimm theory, even though the solutions are within the dilute concentration region as determined using intrinsic viscosity measurements. The effective relaxation times exhibit the expected scaling with molecular weight but with an additional dependence on the concentration of the polymer in solution. This is consistent with the expectation that the polymer molecules are in fact highly extended during the approach to the pinch region (i.e., prior to the elastocapillary filament thinning regime) and subsequently as the filament is formed they are further extended by filament stretching at a constant rate until full extension of the polymer coil is achieved. In this highly extended state, intermolecular interactions become significant, producing relaxation times far above theoretical predictions for dilute polymer solutions under equilibrium conditions.

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are capable of probing and responding to the mechanical properties of their substrate. Although most biological and synthetic matrices are viscoelastic materials, previous studies have primarily focused upon substrate compressive modulus (rigidity), neglecting the relative contributions that the storage (elastic) and loss (viscous) moduli make to the summed compressive modulus. In this study we aimed to isolate and identify the effects of the viscous component of a substrate on hMSC behaviour. Using a polyacrlyamide gel system with constant compressive modulus and varying loss modulus we determined that changes to substrate loss modulus substantially affected hMSC morphology, proliferation and differentiation potential. In addition, we showed that the effect of substrate loss modulus on hMSC behaviour is due to a reduction in both passive and actively generated isometric cytoskeletal tension caused by the inherent creep of substrates with a high loss modulus. These findings highlight substrate creep, or more explicitly substrate loss modulus, as an important mechanical property of a biomaterial system that can be tailored to encourage the growth and differentiation of specific cell types.

Abstract We investigate the dynamics of the capillary thinning and break-up process for low viscosity elastic fluids such as dilute polymer solutions. Standard measurements of the evolution of the midpoint diameter of the necking fluid filament are augmented by high speed digital video images of the break up dynamics. We show that the successful operation of a capillary thinning device is governed by three important time scales (which characterize the relative importance of inertial, viscous and elastic processes), and also by two important length scales (which specify the initial sample size and the total stretch imposed on the sample). By optimizing the ranges of these geometric parameters, we are able to measure characteristic time scales for tensile stress growth as small as 1 millisecond for a number of model dilute and semi-dilute solutions of polyethylene oxide (PEO) in water and glycerol. If the final aspect ratio of the sample is too small, or the total axial stretch is too great, measurements are limited, respectively, by inertial oscillations of the liquid bridge or by the development of the well-known beads-on-a-string morphology which disrupt the formation of a uniform necking filament. By considering the magnitudes of the natural time scales associated with viscous flow, elastic stress growth and inertial oscillations it is possible to construct an “operability diagram” characterizing successful operation of a capillary breakup extensional rheometer. For Newtonian fluids, viscosities greater than approximately 70 mPas are required; however for dilute solutions of high molecular weight polymer, the minimum viscosity is substantially lower due to the additional elastic stresses arising from molecular extension. For PEO of molecular weight 2 · 10 6 g/mol, it is possible to measure relaxation times of order 1 ms in dilute polymer solutions with zero-shear-rate viscosities on the order of 2 – 10 mPas.

Abstract Degeneration of the nucleus pulposus (NP) is a major contributor to intervertebral disc degeneration (IVDD) and low back pain. However, the underlying molecular complexity and cellular heterogeneity remain poorly understood. Here, we first reported a comprehensive single-cell resolution transcriptional landscape of human NP. Six novel human nucleus pulposus cell (NPCs) populations were identified by distinct molecular signatures. The potential functional differences among NPC subpopulations were analyzed at the single-cell level. Predictive genes, transcriptional factors, and signal pathways with respect to degeneration grades were analyzed. We reported that fibroNPCs, one of our identified subpopulations, might be a population for NP regeneration. CD90+NPCs were observed to be progenitor cells in degenerative NP tissues. NP-infiltrating immune cells comprise a previously unrecognized diversity of cell types, including granulocytic myeloid-derived suppressor cells (G-MDSCs). We uncovered CD11b, OLR1, and CD24 as surface markers of NP-derived G-MDSCs. The G-MDSCs were also found to be enriched in mildly degenerated (grade I and II) NP tissues compared to severely degenerated (grade III and IV) NP tissues. Their immunosuppressive function and protective effects for NPCs were revealed. Collectively, this study revealed the NPC type complexity and phenotypic characteristics in NP, providing new insights and clues for IVDD treatment.

ABSTRACT Both the choroid plexus (CP) and the cortex are derived from the rostral neural tube during early embryonic development. In addition to producing CSF, the CP secretes essential factors that orchestrate cortical development and later neurogenesis. Previous brain modeling efforts with human pluripotent stem cells (hPSCs) generated either cortical or CP tissues in 3D culture. Here, we used hPSC-derived neuroectodermal cells, the building blocks of the anterior body, to simultaneously generate CP that forms ventricles and cortical cells in organoids (CVCOs), which can be maintained as 3D organoid cultures. Large scale culture revealed reproducibility of the protocol independent of cell lines, clones or batches. CVCOs contain mature and functional CP that projects multiple cilia into the ventricle-like fluid filled cysts and is in direct contact with appropriately patterned cortical cells. CVCOs thus recapitulate key features of developing forebrain structures observed in in vivo and constitute a useful for dissecting the role of CP in human forebrain development in health and disease.

Why individuals with Down syndrome (DS) are more susceptible to SARS-CoV-2–induced neuropathology remains elusive. Choroid plexus (ChP) plays critical roles in barrier function and immune response modulation and expresses the ACE2 receptor and the chromosome 21–encoded TMPRSS2 protease, suggesting its substantial role in establishing SARS-CoV-2 infection in the brain. To explore this, we established brain organoids from DS and isogenic euploid iPSC that consist of a core of functional cortical neurons surrounded by a functional ChP-like epithelium (ChPCOs). DS-ChPCOs recapitulated abnormal DS cortical development and revealed defects in ciliogenesis and epithelial cell polarity in ChP-like epithelium. We then demonstrated that the ChP-like epithelium facilitates infection and replication of SARS-CoV-2 in cortical neurons and that this is increased in DS. Inhibiting TMPRSS2 and furin activity reduced viral replication in DS-ChPCOs to euploid levels. This model enables dissection of the role of ChP in neurotropic virus infection and euploid forebrain development and permits screening of therapeutics for SARS-CoV-2–induced neuropathogenesis.

Abstract Cellular senescence is characterised by a state of permanent cell cycle arrest. It is accompanied by often variable release of the so-called senescence-associated secretory phenotype (SASP) factors, and occurs in response to a variety of triggers such as persistent DNA damage, telomere dysfunction, or oncogene activation. While cellular senescence is a recognised driver of organismal ageing, the extent of heterogeneity within and between different senescent cell populations remains largely unclear. Elucidating the drivers and extent of variability in cellular senescence states is important for discovering novel targeted seno-therapeutics and for overcoming cell expansion constraints in the cell therapy industry. Here we combine cell biological and single cell RNA-sequencing approaches to investigate heterogeneity of replicative senescence in human ESC-derived mesenchymal stem cells (esMSCs) as MSCs are the cell type of choice for the majority of current stem cell therapies and senescence of MSC is a recognized driver of organismal ageing. Our data identify three senescent subpopulations in the senescing esMSC population that differ in SASP, oncogene expression, and escape from senescence. Uncovering and defining this heterogeneity of senescence states in cultured human esMSCs allowed us to identify potential drug targets that may delay the emergence of senescent MSCs in vitro and perhaps in vivo in the future.