Abstract Compared to folded proteins, the sequences of intrinsically disordered proteins (IDPs) are enriched in polar and charged amino acids. Glutamate is one of the most enriched amino acids in IDPs, while the chemically similar amino acid aspartate is less enriched. So far, the underlying functional differences of glutamates and aspartates in IDPs remain poorly understood. In this study, we examine the differential effects of aspartate and glutamates in IDPs by comparing the function and conformational ensemble of glutamate and aspartate variants of the disordered protein Dss1, using a range of assays, including interaction studies, nuclear magnetic resonance spectroscopy, small angle X-ray scattering and molecular dynamics simulation. First, we analyze the sequences of the rapidly growing data base of experimentally verified IDPs (DisProt) and show that the glutamate enrichment is not caused by a taxonomy bias in IDPs. From analyses of local and global structural properties as well as cell growth and protein-protein interactions using a model acidic IDP from yeast and three Glu/Asp variants, we find that while Glu/Asp support similar function and global dimensions, the variants differ in their binding affinities and population of local transient structural elements. We speculate that these local structural differences may play roles in functional diversity where glutamates can support increased helicity important for folding and binding, while aspartates support extended structures and form helical caps, as well as playing more relevant roles in e.g., transactivation domains and ion-binding.

ABSTRACT ARGONAUTE (AGO) proteins bind to small non-coding RNAs to form RNA Induced Silencing Complexes (RISCs). In the RNA-bound state, AGO proteins are stable while RNA-free AGOs turn over rapidly. Molecular determinants unique to RNA-free AGO that allow its specific recognition and degradation remain unknown. Here, we show that a confined, linear region in Arabidopsis AGO1, the N-coil, is accessible to antibodies preferentially in the RNA-free state of AGO1. Reanalysis of hydrogen-deuterium exchange data on human Ago2 indicates similar structural flexibility of the N-coil depending on small RNA binding. Unloaded Arabidopsis AGO1 interacts with the autophagy cargo receptor ATI1 via direct contact to specific amino acid residues in the N-coil, and mutation of residues required for ATI1 interaction reduces the degradation rate of unloaded AGO1 in vivo . These results provide insight into the molecular basis for specific recognition and degradation of the RNA-free state of eukaryotic AGO proteins.

Abstract Tryptophan hydroxylase 2 (TPH2) catalyzes the rate-limiting step in the biosynthesis of serotonin in the brain. Consequently, regulation of TPH2 is relevant for serotonin related diseases, yet, the regulatory mechanism of TPH2 is poorly understood and structural as well as dynamical insights are missing. Here, we use NMR spectroscopy to determine the structure of a 47 N-terminally truncated variant of the regulatory domain (RD) dimer of human TPH2 in complex with L-Phe, and show that L-Phe is the superior RD ligand compared to the natural substrate, L-Trp. Using cryo-EM we obtain a low-resolution structure of a similarly truncated variant of the complete tetrameric enzyme with dimerized RDs. The cryo-EM 2D class averages additionally indicate that the RDs are dynamic in the tetramer and likely exist in a monomer-dimer equilibrium. Our results provide structural information on the RD both as an isolated domain and in the TPH2 tetramer, which will facilitate future elucidation of TPH2’s regulatory mechanism affecting serotonin regulation.

Abstract Gaussia luciferase (GLuc) is one of the most luminescent luciferases known and is widely used as a reporter in biochemistry and cell biology. During catalysis GLuc undergoes inactivation by irreversible covalent modification. The mechanism by which GLuc generates luminescence and how it becomes inactivated are however not known. Here we show that GLuc unlike other enzymes has an extensively disordered structure with a minimal hydrophobic core and no apparent binding pocket for the main substrate, coelenterazine. From an alanine scan, we identified two Arg residues required for light production. These residues separated with an average of about 22 Å and a major structural rearrangement is required if they are to interact with the substrate simultaneously. We furthermore show that in addition to coelenterazine, GLuc also can oxidize furimazine, however, in this case without production of light. Both substrates result in the formation of adducts with the enzyme, which eventually leads to enzyme inactivation. Our results demonstrate that a rigid protein structure and substrate binding site are no prerequisites for high enzymatic activity and specificity. In addition to the increased understanding of enzymes in general, the findings will facilitate future improvement of GLuc as a reporter luciferase. Significance statement Enzymes are typically characterized by an overall globular structure with a hydrophobic core and a defined cavity for binding of substrate, containing the active site amino acid residues. Gaussia Luciferase is a widely used luminescent reporter with a very strong, albeit short-lived, flash of light due to rapid auto-inactivation. We show, using solution NMR, that while this luciferase shows some secondary structure elements held together by disulfide bonds this highly unusual enzyme is extensively disordered with essentially no hydrophobic core. Although the enzymatic mechanism remains unknown, we have identified two essential arginine residues but, in the structure, these do not point into a common active site. In spite of this, the enzyme has high substrate specificity suggesting that it undergoes major structural rearrangements upon binding of substrate.

Abstract Gaussia luciferase (GLuc) is one of the most luminescent luciferases known and is widely used as a reporter in biochemistry and cell biology. During catalysis, GLuc undergoes inactivation by irreversible covalent modification. The mechanism by which GLuc generates luminescence and how it becomes inactivated are however not known. Here, we show that GLuc unlike other enzymes has an extensively disordered structure with a minimal hydrophobic core and no apparent binding pocket for the main substrate, coelenterazine. From an alanine scan, we identified two Arg residues required for light production. These residues separated with an average of about 22 Å and a major structural rearrangement is required if they are to interact with the substrate simultaneously. We furthermore show that in addition to coelenterazine, GLuc also can oxidize furimazine, however, in this case without production of light. Both substrates result in the formation of adducts with the enzyme, which eventually leads to enzyme inactivation. Our results demonstrate that a rigid protein structure and substrate‐binding site are no prerequisites for high enzymatic activity and specificity. In addition to the increased understanding of enzymes in general, the findings will facilitate future improvement of GLuc as a reporter luciferase.

Integrins are fundamental for cell adhesion and the formation of focal adhesions (FA). Accordingly, these receptors guide embryonic development, tissue maintenance, and haemostasis but are also involved in cancer invasion and metastasis. A detailed understanding of the molecular interactions that drive integrin activation, FA assembly, and downstream signalling cascades is critical. Here, we reveal a direct association of paxillin, a marker protein of FA sites, with the cytoplasmic tails of the integrin β1 and β3 subunits. The binding interface resides in paxillin’s LIM3 domain, where based on the NMR structure and functional analyses, a flexible, 7-amino acid loop engages the unstructured part of the integrin cytoplasmic tail. Genetic manipulation of the involved residues in either paxillin or integrin β3 compromises cell adhesion and motility of murine fibroblasts. This direct interaction between paxillin and the integrin cytoplasmic domain identifies an alternative, kindlin-independent mode of integrin outside-in signalling particularly important for integrin β3 function.

Abstract The homo-dimeric, ring-shaped bacterial DNA sliding clamp, β-clamp, is a central hub in DNA replication and repair. It interacts with a plethora of proteins via short linear motifs, which bind to the same hydrophobic binding pocket on β-clamp. Although the structure, functions and interactions of β-clamp have been amply studied, less focus has been on understanding its dynamics and how this is influenced by ligand binding. In this work, we have made a backbone nuclear magnetic resonance (NMR) assignment of the 83 kDa dimeric β-clamp and used NMR in combination with hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to scrutinize the dynamics of β-clamp and how different ligands affect this. We found that binding of a small peptide from the polymerase III α subunit affects the dynamics and stability of β-clamp. This effect not only appears locally around the binding pocket, but also globally through dynamic allosteric connections to distant regions of the protein, including the dimer interface. This dissipated dynamic effect is likely a consequence of the binding pocket architecture and may reflect a common mechanism of structural plasticity, where different ligands impose differential responses in the structure and dynamics of β-clamp. Highlights NMR spectroscopy of β-clamp revealed its inherent dynamics A peptide ligand from polymerase III stabilizes β-clamp from global unfolding Peptide binding causes allosteric effects that manifest in changes in dynamics Dynamic changes occur distant to the binding pocket in the dimer interface Allostery may be a mechanism for differential responses to interaction partners Graphical abstract

Abstract Slow conformational changes are often directly linked to protein function. It is however less clear how such processes may perturb the overall folding stability of a protein. We previously found that the stabilizing double mutant L49I/I57V in the small protein chymotrypsin inhibitor 2 from barley led to distributed increased nano second and faster dynamics. Here we asked what effect this mutant and the two individual mutants L49I and I57V have on the slow conformational dynamics of CI2. We used 15 N CPMG spin relaxation dispersion experiments to measure the kinetics, thermodynamics and structural changes associated with slow conformational change in CI2. These changes result in an excited state that is populated to 4.3% at 1 °C. As the temperature is increased the population of the excited state decreases. Structural changes in the transition to the excited state are associated with residues that interact with water molecules that have well defined positions and are found at these positions in all crystal structures of CI2. The mutations in CI2 have only little effect on the structure of the excited state whereas the stability of the excited state to some extent follows the stability of the main state. The minor state is thus most populated for the most stable CI2 variant and least populated for the least stable variant. We hypothesize that the interactions between the mutated residues and the well-ordered water molecules links subtle structural changes around the mutated residues to the region in the protein that experience slow conformational changes.

Abstract Integrins are fundamental for cell adhesion and the formation of focal adhesions (FA). Accordingly, these receptors guide embryonic development, tissue maintenance and haemostasis, but are also involved in cancer invasion and metastasis. A detailed understanding of the molecular interactions that drive integrin activation, focal adhesion assembly, and downstream signalling cascades is critical. Here, we reveal a direct association of paxillin, a marker protein of focal adhesion sites, with the cytoplasmic tails of the integrin β1 and β3 subunits. The binding interface resides in paxillin’s LIM3 domain, where based on the NMR structure and functional analyses a flexible, seven amino acid loop engages the unstructured part of the integrin cytoplasmic tail. Genetic manipulation of the involved residues in either paxillin or integrin β3 compromises cell adhesion and motility. This direct interaction between paxillin and the integrin cytoplasmic domain identifies an alternative, kindlin-independent mode of integrin outside-in signalling particularly important for integrin β3 function.

Abstract More than 1600 human transcription factors orchestrate the transcriptional machinery to control gene expression and cell fate. Their function is conveyed through intrinsically disordered regions (IDRs) containing activation or repression domains but lacking quantitative structural ensemble models prevents their mechanistic decoding. Here we integrate single-molecule FRET and NMR spectroscopy with molecular simulations showing that DNA binding can lead to complex changes in the IDR ensemble and accessibility. The C-terminal IDR of pioneer factor Sox2 is highly disordered but its conformational dynamics are guided by weak and dynamic charge interactions with the folded DNA binding domain. Both DNA and nucleosome binding induce major rearrangements in the IDR ensemble without affecting DNA binding affinity. Remarkably, interdomain interactions are redistributed in complex with DNA leading to variable exposure of two activation domains critical for transcription. Charged intramolecular interactions allowing for dynamic redistributions may be common in transcription factors and necessary for sensitive tuning of structural ensembles.