Abstract The global rise of antimicrobial resistance poses a serious threat to public health. Because drug-resistant (DR) pathogens typically carry mutations in genes involved in critical cellular functions, they may be less fit under drug-free conditions than their susceptible counterparts. As such, the limited use of antimicrobial drugs has been proposed as a practical strategy to diminish the prevalence of DR strains. However, in many cases the fitness of DR pathogens under host conditions is unknown. Candida ( Nakaseomyces ) glabrata is a prevalent opportunistic fungal pathogen notable for its high rate of fluconazole resistance (FLZR), echinocandin resistance (ECR), and multidrug resistance (MDR) relative to other Candida pathogens. Nonetheless, the fitness of C. glabrata MDR isolates is poorly characterized, and studies of FLZR isolate fitness have produced contradictory findings. Two important host niches for C. glabrata are macrophages, in which it can survive and proliferate, and the gut. Herein, by employing a comprehensive collection of clinical and isogenic C. glabrata isolates, we show that FLZR C. glabrata isolates are less fit inside macrophages than susceptible isolates and that this fitness cost is reversed by acquiring ECR mutations in FKS1/2 genes. Interestingly, dual-RNAseq revealed that macrophages infected with DR isolates mount an inflammatory response whereas the intracellular DR cells downregulate processes required for in-host adaptation. Consistently, DR isolates were outcompeted by their susceptible counterparts in the context of gut colonization and in the kidneys of systemically infected mice, whereas they showed comparable fitness in the spleen. Collectively, our study shows that macrophage-rich organs, such as the spleen, favor the retention of DR isolates, potentially reducing the utility of limited antifungal use to decrease the burden of DR C. glabrata in the context of candidemia. Author summary The rise of multidrug resistant (MDR) strains of fungal pathogens, notably Candida glabrata , poses a significant clinical challenge because of the limited number of antifungal drugs available for use. Thus, it is vital to minimize the prevalence of drug resistance in the clinic. Because in some bacterial and fungal species drug resistance is accompanied by a fitness cost, implementation of limited antibiotic or antifungal drug use in the clinic has been suggested as a practical way to favor the spread of susceptible isolates. However, it is not clear whether this strategy can work for MDR C. glabrata , as its fitness costs have not been systematically examined, particularly in the context of the host. Herein, we show that MDR C. glabrata isolates can replicate within macrophages as well as susceptible isolates, and this result was consistent with gene expression changes in the infected macrophages. In animal models, MDR strains were unfit in the context of the gastrointestinal tract and kidney, but their fitness in the spleen was comparable to that of susceptible strains. Accordingly, the potential of limited antifungal use to reduce the prevalence of MDR strains of C. glabrata strongly depends on the host reservoir of infection.

Interspecific hybridization can drive evolutionary adaptation to novel environments. The Saccharomycotina clade of budding yeasts includes many hybrid lineages, and hybridization has been proposed as a source for new pathogenic species. Candida orthopsilosis is an emerging opportunistic pathogen for which most clinical isolates are hybrids, each derived from one of at least four independent crosses between the same two parental lineages. To gain insight on the transcriptomic aftermath of hybridization in these pathogens, we analyzed allele-specific gene expression in two independently formed hybrid strains, and in a homozygous strain representative of one parental lineage. Our results show that the effect of hybridization on overall gene expression is rather limited, affecting ~4% of the studied genes. However, we identified a larger effect in terms of imbalanced allelic expression, affecting ~9.5% of the heterozygous genes in the hybrids. Some of these altered genes have functions related to pathogenicity, including zinc transport and superoxide dismutase activities. Additionally, the number of shared genes with imbalanced expression in the two independently formed hybrids was higher than random expectation, suggesting selective retention. While it remains unclear whether the observed imbalanced genes play a role in virulence, our results suggest that differences in allele-specific expression may add an additional layer of phenotypic plasticity to traits related to virulence in C. orthopsilosis hybrids.

Abstract Small colony variants (SCVs) are relatively common among some bacterial species and are associated with poor prognosis and recalcitrant infections. Similarly, Candida glabrata – a major intracellular fungal pathogen – produces small and slow-growing respiratory-deficient colonies, termed “petite.” Despite reports of clinical petite C . glabrata strains, our understanding of petite behavior in the host remains obscure. Moreover, controversies exist regarding in-host petite fitness and its clinical relevance. Herein, we employed whole-genome sequencing (WGS), dual-RNAseq, and extensive ex vivo and in vivo studies to fill this knowledge gap. WGS identified multiple petite-specific mutations in nuclear and mitochondrially-encoded genes. Consistent with dual-RNAseq data, petite C . glabrata cells did not replicate inside host macrophages and were outcompeted by their non-petite parents in macrophages and in gut colonization and systemic infection mouse models. The intracellular petites showed hallmarks of drug tolerance and were relatively insensitive to the fungicidal activity of echinocandin drugs. Petite-infected macrophages exhibited a pro-inflammatory and type I IFN-skewed transcriptional program. Interrogation of international C . glabrata blood isolates ( n =1000) showed that petite prevalence varies by country, albeit at an overall low prevalence (0–3.5%). Collectively, our study sheds new light on the genetic basis, drug susceptibility, clinical prevalence, and host-pathogen responses of a clinically overlooked phenotype in a major fungal pathogen. Importance Candida glabrata is a major fungal pathogen, which is able to lose mitochondria and form small and slow-growing colonies, called “petite”. This attenuated growth rate has created controversies and questioned the clinical importance of petiteness. Herein, we have employed multiple omicstechnologies and in vivo mouse models to critically assess the clinical importance of petite phenotype. Our WGS identifies multiple genes potentially underpinning petite phenotype. Interestingly, petite C. glabrata cells engulfed by macrophages are dormant and therefore are not killed by the frontline antifungal drugs. Interestingly, macrophages infected with petite cells mount distinct transcriptomic responses. Consistent with our ex-vivo observations, mitochondrial-proficient parental strains outcompete petites during systemic and gut colonization. Retrospective examination of C. glabrata isolates identified petite prevalence a rare entity, can significantly vary from country to country. Collectively, our study overcomes the existing controversies and provides novel insights regarding the clinical relevance of petite C. glabrata isolates.