Spore and vegetative cell adenylate kinases of Bacillus subtilis proved indistinguishable by polyacrylamide gel electrophoresis DEAE cellulose chromatography

Abstract Bacillus subtilis vegetative cells switch to sporulation upon nutrient limitation. To investigate the proteome dynamics during sporulation, high resolution time-lapse proteomics was performed in a cell population that was induced to sporulate synchronously. Here, we are the first to comprehensively investigate the changeover of sporulation regulatory proteins, coat proteins and other proteins involved in sporulation and spore biogenesis. Protein co-expression analysis revealed four co-expressed modules (blue, brown, green and yellow). Modules brown and green are upregulated during sporulation and contain proteins associated with sporulation. Module blue, is negatively correlated with modules brown and green, and contained ribosomal and metabolic proteins. Finally, module yellow shows co-expression with the three other modules. Notably, several proteins not belonging to any of the known transcription regulons were identified as co-expressed with modules brown and green. We speculate that they may also play roles during sporulation. Finally, levels of some coat proteins, for example morphogenetic coat proteins, decreased late in sporulation. We speculate on their possible role in guiding or helping assembly of other coat proteins, after which they can be disposed of, but such a hypothesis remains to be experimentally addressed.

Abstract The SpoVA proteins make up a channel in the inner membrane (IM) of B. subtilis spore. This channel responds to signals from activated germinant receptors (GRs), and allows release of Ca 2+ -DPA from the spore core during germination. In the current work, we studied the location and dynamics of SpoVAEa in dormant spores. Notably, the SpoVAEa-SGFP2 proteins were present in a single spot in spores, similar to the complex formed by all GRs. However, while the GRs’ spot remains in one location, the SpoVAEa-SGFP2 spot in the IM moved randomly with high frequency. The dynamics of the SpoVAEa-SGFP2 and its surrounding IM region as stained by fluorescent dyes were also tracked during spore germination, as the dormant spore IM appeared to have an immobile germination related functional microdomain. This microdomain disappeared around the time of appearance of a germinated spore, the loss of fluorescence of the IM by fluorescent dyes, as well as the appearance of SpoVAEa-SGFP2 peak fluorescent intensity occurred in parallel. These observed events were highly related to the rapid phase darkening, which is considered as the Ca 2+ DPA rapid release. We also tested the response of SpoVAEa and the IM to thermal treatments at 40-80°C. Heat treatment triggered an increase of green autofluorescence, which is speculated to be due to coat protein denaturation, and 80°C treatments induce the appearance of phase-grey-like spores. These spores presumably have a similar intracellular physical state as the phase grey spores detected in the germination but lack the functional proteins for further germination events.

Abstract Heat activation at a sublethal temperature is widely applied to promote Bacillus species spore germination. This treatment also has potential to be employed in food processing to eliminate undesired bacterial spores by enhancing their germination, and then inactivating the less heat resistant germinated spores at a milder temperature. However, incorrect heat treatment could also generate heat damage in spores, and lead to more heterogeneous spore germination. Here, the heat activation and heat damage profile of Bacillus subtilis spores was determined by testing spore germination and outgrowth at both population and single spore levels. The heat treatments used were 40-80°C, and for 0-300 min. The results were as follows. 1) Heat activation at 40-70°C promoted L-valine and L-asparagine-glucose-fructose-potassium (AGFK) induced germination in a time dependent manner. 2) The optimal heat activation temperatures for AGFK and L-valine germination via the GerB plus GerK or GerA germinant receptors were 65 and 50-65°C, respectively. 3) Heat inactivation of dormant spores appeared at 70°C, and the heat damage of molecules essential for germination and growth began at 70 and 65°C, respectively. 4) Heat treatment at 75°C resulted in both activation of germination and damage to the germination apparatus, and 80°C treatment caused more pronounced heat damage. 5) For the spores that should withstand adverse environmental temperatures in nature, heat activation seems functional for a subsequent optimal germination process, while heat damage affected both germination and outgrowth.

Reliable and comprehensive multi-omics analysis is essential for researchers to understand and explore complex biological systems more completely. Bacillus subtilis is a model organism for Gram-positive spore-forming bacteria, and in-depth insight into the physiology and molecular basis of spore formation and germination in this organism requires advanced multilayer molecular datasets generated from the same sample. In this study, we evaluated two monophasic methods for polar and nonpolar compound extraction (acetonitrile/methanol/water; isopropanol/water, and 60% ethanol), and two biphasic methods (chloroform/methanol/water, and methyl tert-butyl ether/methanol/water) on coefficients of variation of analytes, identified metabolite composition and the quality of proteomics profiles. The analytical workflow comprises (1) parallel metabolite and protein extraction, (2) monophasic or biphasic sample extraction, (3) proteomics comparison and (4) multi-omics-based data visualization. The 60% EtOH protocol proved to be the easiest in sample processing and more amenable to automation. Collectively, we annotated 505 and 484 metabolites and identified 1665 and 1562 proteins in B. subtilis vegetative cells and spores, respectively. We also show differences between vegetative cells and spores from a multi-omics perspective and demonstrated that an integrative multi-omics analysis can be implemented from one sample using the 60% EtOH protocol. Correlation analysis further demonstrated that the metabolome and proteome datasets were highly correlated in content for components annotated to be part of the pyrimidine metabolism pathway. The results obtained by the 60% EtOH protocol provide a comprehensive insight into differences in the metabolic and protein makeup of B. subtilis vegetative cells and spores.

ABSTRACT Bacillus cereus spores, like most Bacillus spores, can survive for years, germinate when their surroundings become suitable, and spore germination proteins play an important role in the initiation of germination. Because germinated spores lose dormant spores’ extreme resistance, information on the function of germination proteins could be useful in developing new strategies to control B. cereus spores. Prior work has shown that: i) the channel protein SpoVAEa exhibits high frequency movement in the outer leaflet of the inner membrane (IM) in dormant spores of B. subtilis ; ii) the formation of the foci termed the germinosome between two germination proteins, the germinant receptor GerR and the scaffold protein GerD, in developing spores of B. cereus is slower than foci formation by GerR and GerD individually. However, the dynamics of movement of SpoVAEa in B. cereus spores, and the behaviour of the germinosome in B. cereus spore germination are unclear. In this study, we found that SpoVAEa fluorescent foci in dormant spores of B. cereus move on the IM, but slower than in B. subtilis spores, and likely colocalize transiently with GerD-mScarlet-I in the germinosome. Our results further indicate that: i) expression of GerR-SGFP2 and SpoVAEa-SGFP2 with GerD-mScarlet-I from a plasmid leads to more heterogeneity and lower efficiency of spore germination in B. cereus ; and ii) germinosome foci observed by Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) between GerR-SGFP2 and GerD-mScarlet-I b can be lost soon after the spore phase transition. However this is not always the case, as some GerR-SGFP2 foci and GerD-mScarlet-I foci continued to exist, colocalize, and even show a weak FRET signal. These data highlight the heterogeneous behaviour of spore germination protein complexes and indicate that some complexes may persist well beyond the initiation of germination. IMPORTANCE Bacillus cereus is commonly present in soil and does harm to humans via contaminated food. In this study, we used B . cereus spores to investigate the movement of the spore-specific channel protein SpoVAEa, the interaction between SpoVAEa and the germinosome scaffold protein GerD, as well as the dynamics of a number of germination proteins in spore germination. Our results expand upon observations of the interactions between specific B. cereus spore germination proteins, in particular the GerR germinant receptor A, B and C subunits and GerD, as well as between SpoVAEa and GerD. The approaches used in this work could also be used to examine the interactions between GerD and SpoVAEa and other germination proteins in spores of other Bacillus species.

Abstract In response to extreme conditions, Bacillus subtilis generates highly resilient spores characterized by a unique multilayered structure. This confers resistance against various chemicals and enzymes yet adding complexity to the analysis of the spore proteome. As the first step in bottom-up proteomics, sample preparation poses a significant challenge. We assessed how an optimized protocol for sample preparation by easy extraction and digestion (SPEED) performed compared to previously established methods “One-pot” (OP) and single-pot, solid phase-enhanced sample-preparation (SP3) for the proteomic analysis of B. subtilis cell and spore samples. We found that SPEED outperformed both OP and SP3 in terms of peptides and proteins identified, moreover SPEED highly reproducibly quantified over 1000 proteins in limited input samples as low as 1 OD 600 of B. subtilis cells and spores. SPEED was applied to analyze spore samples of different purity by applying sequential purification following harvesting of spores. Comparison of the differential abundance of proteins revealed clusters likely partially stemming from remaining vegetative cells in less purified spore samples. We show that ranking of absolute protein abundance in cellular and spore samples further enables us to rationally differentiate integral spore proteins from vegetative remnants. This is of importance in applications and organisms where highly homogenous spore samples are difficult to obtain. A deep proteomic analysis of spore and vegetative cell samples with the new approach led to the identification of 2447 proteins, 2273 of which were further quantified and compared between B. subtilis spores and cells. Our findings indicate that pathways related to peptidoglycan biosynthesis, glycolysis, carbon metabolism, and biosynthesis of secondary metabolites are shared between cells and spores. This corroborates and extends earlier work stressing that despite marked differences in their physiological states, spores preserve vegetative cell (core) proteins, essential for revival under conditions conducive to growth. Abstract Figure