The outer membrane of gram-negative bacteria is a barrier to chemical and physical stress. Phospholipid transport between the inner and outer membranes has been an area of intense investigation and, in E . coli K-12, it has recently been shown to be mediated by YhdP, TamB, and YdbH, which are suggested to provide hydrophobic channels for phospholipid diffusion, with YhdP and TamB playing the major roles. However, YhdP and TamB have different phenotypes suggesting distinct functions. It remains unclear whether these functions are related to phospholipid metabolism. We investigated a synthetic cold sensitivity caused by deletion of fadR , a transcriptional regulator controlling fatty acid degradation and unsaturated fatty acid production, and yhdP , but not by Δ tamB Δ fadR or Δ ydbH Δ fadR . Deletion of tamB recuses the Δ yhdP Δ fadR cold sensitivity further demonstrating the phenotype is related to functional diversification between these genes. The Δ yhdP Δ fadR strain shows a greater increase in cardiolipin upon transfer to the non-permissive temperature and genetically lowering cardiolipin levels can suppress cold sensitivity. These data also reveal a qualitative difference between cardiolipin synthases in E . coli , as deletion of clsA and clsC suppresses cold sensitivity but deletion of clsB does not. Moreover, increased fatty acid saturation is necessary for cold sensitivity and lowering this level genetically or through supplementation of oleic acid suppresses the cold sensitivity of the Δ yhdP Δ fadR strain. Together, our data clearly demonstrate that the diversification of function between YhdP and TamB is related to phospholipid metabolism. Although indirect regulatory effects are possible, we favor the parsimonious hypothesis that YhdP and TamB have differential phospholipid-substrate transport preferences. Thus, our data provide a potential mechanism for independent control of the phospholipid composition of the inner and outer membranes in response to changing conditions based on regulation of abundance or activity of YhdP and TamB.

Abstract The outer membrane of diderm Gram-negative bacteria acts as a barrier from chemical and physical stress. Anterograde phospholipid transport to the outer membrane has long been an area of intense investigation and, in E. coli K-12, it has recently been shown to be mediated by three related proteins: YhdP, TamB, and YdbH, which appear to provide hydrophobic channels for phospholipid diffusion, with YhdP and TamB playing the major roles. However, YhdP and TamB have different phenotypes suggesting distinct phospholipid transport functions. We investigated these functions using the synthetic cold sensitivity of a strain with Δ yhdP (but not Δ tamB or Δ ydbH ) and Δ fadR , a transcriptional regulator allowing switching between fatty acid degradation and synthesis and regulating unsaturated fatty acid production. Deletion of tamB , forcing phospholipid transport to YdbH, suppresses the Δ yhdP Δ fadR cold sensitivity suggesting this phenotype is due to TamB dysfunction. Increased levels of cardiolipin and fatty acid saturation are necessary for cold sensitivity and lowering levels of either suppresses this sensitivity. Our data support a model where YhdP primarily transports more saturated phospholipids, TamB primarily transports phospholipids with more than one carbon unsaturation, and cardiolipin obstructs TamB by selectively clogging its channel. Thus, the multiple phospholipid transporters may allow the saturation state of the outer membrane to be regulated independently of the inner membrane by altering the YhdP-TamB activity ratio. Maintaining membrane physical integrity and function under changing conditions may require envelope remodeling including altered phospholipid composition and intermembrane trafficking. Our data provide a potential mechanism for this regulation. Importance Gram-negative bacteria possess an impermeable outer membrane protecting against environmental stress and antibiotics. Outer membrane phospholipid transport remained mysterious until recently when YhdP, TamB, and YdbH were implicated in phospholipid transport between the inner and outer membranes of E. coli . TamB also modulates phospholipid transport in a distantly related diderm Fermicute. Here, we investigate functional differentiation between YhdP and TamB. Our data strongly suggest YhdP’s and TamB’s functions are distinguished by the saturation state of phospholipids with YhdP preferentially transporting more saturated phospholipids and TamB transporting more unsaturated phospholipids. Cardiolipin headgroup specificity may also contribute to TamB inhibition, perhaps due to the bulky nature of cardiolipin inhibiting the passage of other phospholipids. Diversification of function between YhdP and TamB provides a mechanism for regulation of phospholipid composition, and possibly the mechanical strength and permeability of the outer membrane, and so the cell’s intrinsic antibiotic resistance, in changing environmental conditions.

Abstract The outer membrane (OM) of Gram-negative bacteria is a selective permeability barrier that allows uptake of nutrients while simultaneously protecting the cell from harmful compounds. The basic pathways and molecular machinery responsible for transporting lipopolysaccharides (LPS), lipoproteins, and β-barrel proteins to the OM have been identified, but very little is known about phospholipid (PL) transport. To identify genes capable of affecting PL transport, we screened for genetic interactions with mlaA *, a mutant in which anterograde PL transport causes the inner membrane (IM) to shrink and eventually rupture; characterization of mlaA *-mediated lysis suggested that PL transport can occur via a high-flux, diffusive flow mechanism. We found that YhdP, an IM protein involved in maintaining the OM permeability barrier, modulates the rate of PL transport during mlaA *-mediated lysis. Deletion of yhdP from mlaA * reduced the rate of IM transport to the OM by 50%, slowing shrinkage of the IM and delaying lysis. As a result, the weakened OM of Δ ydhP cells was further compromised and ruptured before the IM during mlaA *-mediated death. These findings demonstrate the existence of a high-flux, diffusive pathway for PL flow in Escherichia coli that is modulated by YhdP. Significance Statement The outer membrane (OM) of Gram-negative bacteria serves as a barrier that protects cells from harmful chemical compounds, including many antibiotics. Understanding how bacteria build this barrier is an important step in engineering strategies to circumvent it. A long-standing mystery in the field is how phospholipids (PLs) are transported from the inner membrane (IM) to the OM. We previously discovered that a mutation in the gene mlaA causes rapid flow of PLs to the OM, eventually resulting in IM rupture. Here, we found that deletion of the gene yhdP delayed cell death in the mlaA mutant by slowing flow of PLs to the OM. These findings reveal a high-flux, diffusive pathway for PL transport in Gram-negative bacteria modulated by YhdP.