Correct spindle positioning is fundamental for proper cell division during development and in stem cell lineages. Dynein and an evolutionarily conserved ternary complex (nuclear mitotic apparatus protein [NuMA]–LGN–Gα in human cells and LIN-5–GPR-1/2–Gα in Caenorhabditis elegans) are required for correct spindle positioning, but their relationship remains incompletely understood. By analyzing fixed specimens and conducting live-imaging experiments, we uncovered that appropriate levels of ternary complex components are critical for dynein-dependent spindle positioning in HeLa cells and C. elegans embryos. Moreover, using mutant versions of Gα in both systems, we established that dynein acts at the membrane to direct spindle positioning. Importantly, we identified a region within NuMA that mediates association with dynein. By using this region to target dynein to the plasma membrane, we demonstrated that the mere presence of dynein at that location is sufficient to direct spindle positioning in HeLa cells. Overall, we propose a model in which the ternary complex serves to anchor dynein at the plasma membrane to ensure correct spindle positioning.

SUMMARY Centrioles are lost during oogenesis in most metazoans, ensuring that the zygote is endowed with the correct number of two centrioles, which are paternally contributed. How centriole architecture is dismantled during oogenesis is not understood. Here, we analyze with unprecedent detail the ultrastructural and molecular changes during oogenesis centriole elimination in C. elegans . Centriole elimination begins with loss of the so-called central tube and organelle widening, followed by microtubule disassembly. The resulting cluster of centriolar proteins then disappears gradually, usually moving in a microtubule- and dynein-dependent manner to the plasma membrane. Moreover, we find that neither Polo-like kinases nor the PCM, which modulate oogenesis centriole elimination in Drosophila , do so in C. elegans . Furthermore, we demonstrate that the central tube protein SAS-1 normally departs first from the organelle, which loses integrity earlier in sas-1 mutants. Overall, our work provides novel mechanistic insights regarding the fundamental process of oogenesis centriole elimination.

Abstract The excavate Naegleria gruberi, a basal eukaryote related to the “brain eating” Naegleria fowleri , can transform transiently from an amoeboid life form lacking flagella and centrioles to a flagellate life form where these elements are present, followed by reversion to an amoeboid state. The mechanisms imparting elimination of axonemes and centrioles during this reversion process are not known. Here, we uncover that flagella primarily fold onto the cell surface and fuse within milliseconds with the plasma membrane. Once internalized, axonemes are severed by Spastin into equally-sized fragments, which are then enclosed by membranes, after which their contents are eliminated through the lysosomal pathway. Moreover, we discovered that centrioles undergo progressive K63 autophagy-linked poly-ubiquitination and K48 proteasome-promoting poly-ubiquitination, and that ubiquitination occurs next to centriolar microtubules. Most centrioles are eliminated in lysosomes or the cytoplasm in a lysosomal- and proteasome-dependent manner. Strikingly, we uncover in addition that centrioles can be shed in the extracellular milieu and taken up by other cells. Collectively, these findings reveal fundamental mechanisms governing the elimination of essential cellular constituents in Naegleria that may operate broadly in eukaryotic systems. IMPORTANT Manuscripts submitted to Review Commons are peer reviewed in a journal-agnostic way. Upon transfer of the peer reviewed preprint to a journal, the referee reports will be available in full to the handling editor. The identity of the referees will NOT be communicated to the authors unless the reviewers choose to sign their report. The identity of the referee will be confidentially disclosed to any affiliate journals to which the manuscript is transferred. GUIDELINES For reviewers: https://www.reviewcommons.org/reviewers For authors: https://www.reviewcommons.org/authors CONTACT The Review Commons office can be contacted directly at: office@reviewcommons.org

Abstract The centriole is a minute cylindrical organelle present in a wide range of eukaryotic species. Most centrioles have a signature 9-fold radial symmetry of microtubules that is imparted onto the axoneme of the cilia and flagella they template, with 9 centriolar microtubule doublets growing into 9 axonemal microtubule doublets. There are exceptions to the 9-fold symmetrical arrangement of axonemal microtubules, with lower or higher fold symmetries in some species. In the few cases where this has been examined, such alterations in axonemal symmetries are grounded in likewise alterations in centriolar symmetries. Here, we examine the question of microtubule number continuity between centriole and axoneme in flagellated gametes of the gregarine Lecudina tuzetae , which have been reported to exhibit a 6-fold radial symmetry of axonemal microtubules. We used time-lapse differential interference microscopy to identify the stage at which flagellated gametes are present. Thereafter, using electron microscopy and ultrastructure-expansion microscopy coupled to STimulated Emission Depletion (STED) super-resolution imaging, we uncover that a 6- or 5-fold radial symmetry in the axoneme is accompanied by an 8-fold radial symmetry in the centriole. We conclude that there can be plasticity in the transition between centriolar and axonemal microtubules.

Abstract Uncovering organizing principles of organelle assembly is a fundamental pursuit in the life sciences. C. elegans was key in identifying evolutionary conserved components governing assembly of the centriole organelle. However, localizing these components with high precision has been hampered by the minute size of the worm centriole, thus impeding understanding of underlying assembly mechanisms. Here, we used Ultrastructure Expansion coupled with STimulated Emission Depletion microscopy (U-Ex-STED), as well as electron microscopy (EM) and tomography (ET), to decipher the molecular architecture of the worm centriole. Achieving an effective lateral resolution of ∼14 nm, we localize centriolar and PeriCentriolar Material (PCM) components in a comprehensive manner with utmost spatial precision. We uncovered that the procentriole assembles from a location on the centriole margin characterized by SPD-2 and ZYG-1 accumulation. Moreover, we found that SAS-6 and SAS-5 are present in the nascent procentriole, with SAS-4 and microtubules recruited thereafter. We registered U-Ex-STED and EM data using the radial array of microtubules, thus allowing us to map each centriolar and PCM protein to a specific ultrastructural compartment. Importantly, we discovered that SAS-6 and SAS-4 exhibit a radial symmetry that is offset relative to microtubules, leading to a chiral centriole ensemble. Furthermore, we establish that the centriole is surrounded by a region from which ribosomes are excluded and to which SAS-7 localizes. Overall, our work uncovers the molecular architecture of the C. elegans centriole in unprecedented detail and establishes a comprehensive framework for understanding mechanisms of organelle biogenesis and function.

ABSTRACT TRIM37 is an E3 ubiquitin ligase mutated in Mulibrey nanism, a disease characterized by impaired growth and increased tumorigenesis, whose cellular etiology is poorly understood. TRIM37 depletion from tissue culture cells results in supernumerary foci bearing the centriolar protein Centrin. Here, we characterized these centriolar protein assemblies (Cenpas) to uncover the mechanism of action of TRIM37. We established that an atypical de novo assembly pathway is notably involved in forming Cenpas, which can nevertheless trigger further centriole assembly and act as MTOCs. We found also that Cenpas are present and act similarly in Mulibrey patient cells. Through correlative light electron microscopy, we uncovered that Cenpas correspond to centriole related structures and elongated electron-dense structures with stripes. Importantly, we established that TRIM37 regulates the stability and solubility of the centriolar protein Centrobin. Our findings suggest that elongated Centrobin assemblies are a major constituent of the striped electron dense structures. Furthermore, we established that Cenpas formation upon TRIM37 depletion requires PLK4 activity, as well as two parallel pathways relying respectively on Centrobin and PLK1. Overall, our work uncovers how TRIM37 prevents the formation of Cenpas that would otherwise threaten genome integrity, including possibly in Mulibrey patients.

Abstract How living systems break symmetry in an organized manner is an important question in biology. In C. elegans zygotes, symmetry breaking normally occurs in the vicinity of centrosomes, resulting in anterior-directed cortical flows and establishment of a single posterior PAR-2 domain. Here, we report that zygotes depleted of the Aurora A kinase AIR-1 or of centrosomes establish two posterior domains, one at each pole. Using transgenic animals and microfabricated triangular chambers, we establish that such bipolarity occurs in a PAR-2- and curvature-dependent manner. Furthermore, we develop an integrated physical model of symmetry breaking, establishing that local PAR-dependent weakening of the actin cortex, together with mutual inhibition of anterior and posterior PAR proteins, provides a mechanism for self-organized PAR polarization without functional centrosomes in C. elegans . One Sentence Summary We uncover a novel centrosome-independent mechanism of polarization in C. elegans zygotes