Abstract Microbiology and synthetic biology depend on reverse genetic approaches to manipulate bacterial genomes; however, existing methods require molecular biology to generate genomic homology, suffer from low efficiency, and are not easily scaled to high throughput applications. To overcome these limitations, we developed a system for creating kilobase-scale genomic modifications that uses DNA oligonucleotides to direct the integration of a non-replicating plasmid. This method, Oligonucleotide Recombineering followed by Bxb-1 Integrase Targeting (ORBIT) was pioneered in Mycobacteria , and here we adapt and expand it for E. coli . Our redesigned plasmid toolkit achieved nearly 1000x higher efficiency than λ Red recombination and enabled precise, stable knockouts ( < 134 kb) and integrations ( < 11 kb) of various sizes. Additionally, we constructed multi-mutants (double and triple) in a single transformation, using orthogonal attachment sites. At high throughput, we used pools of targeting oligonucleotides to knock out nearly all known transcription factor and small RNA genes, yielding accurate, genome-wide, single mutant libraries. By counting genomic barcodes, we also show ORBIT libraries can scale to thousands of unique members (>30k). This work demonstrates that ORBIT for E. coli is a flexible reverse genetic system that facilitates rapid construction of complex strains and readily scales to create sophisticated mutant libraries.

Dodder (Cuscuta spp.) is a dangerous parasitic plant that causes serious damage to crop production and is challenging to eliminate. Herbicide application is a common strategy to control dodder in the field, but it is costly, ineffective, and further results in hazardous outcomes. Therefore, our study aims to identify the potential pathogens in naturally occurring dodder infections which may provide efficient biocontrol options. In this regard, the pathogens were isolated from the infected plants, their pathogenicity was validated through inoculation, and the optimal culture conditions for their growth were identified by determining the pathogenicity difference. The pathogenicity range was determined in vitro using the leaves of common horticultural plants and crops. Furthermore, a small range of horticultural plants parasitized by Cuscuta reflexa in the field were inoculated with the pathogen to determine their biosafety and biocontrol potential, and the pathogens were identified by morphological and molecular characterization. We found 7 strains that were isolated after pathogen enrichment culture. Among them, Cbp6 and Cbp7 showed the highest pathogenicity against C. reflexa. After testing the inoculation of more than 50 species of plants, only 9 species showed varying degrees of lesions on leaves, which proved the high biosafety for common plants. Field spraying of these pathogens showed a good control effect on C. reflexa after 21 days; the disease severityreached 66.0%, while its host plant did not display obvious symptoms. In conclusion, the pathogens Cbp6 and Cbp7 were identified as Alternaria alternata, and the results of this study provide a theoretical basis for the biological control of dodder.