Abstract Homologous recombination (HR) deficiency enhances sensitivity to DNA damaging agents commonly used to treat cancer. In HR-proficient cancers, metabolic mechanisms driving response or resistance to DNA damaging agents remain unclear. Here we identified that depletion of alpha-ketoglutarate (αKG) sensitizes HR-proficient cells to DNA damaging agents by metabolic regulation of histone acetylation. αKG is required for the activity of αKG-dependent dioxygenases (αKGDDs), and prior work has shown that changes in αKGDD affect demethylases. Using a targeted CRISPR knockout library consisting of 64 αKGDDs, we discovered that Trimethyllysine Hydroxylase Epsilon (TMLHE), the first and rate-limiting enzyme in de novo carnitine synthesis, is necessary for proliferation of HR-proficient cells in the presence of DNA damaging agents. Unexpectedly, αKG-mediated TMLHE-dependent carnitine synthesis was required for histone acetylation, while histone methylation was affected but dispensable. The increase in histone acetylation via αKG-dependent carnitine synthesis promoted HR-mediated DNA repair through site- and substrate-specific histone acetylation. These data demonstrate for the first time that HR-proficiency is mediated through αKG directly influencing histone acetylation via carnitine synthesis and provide a metabolic avenue to induce HR-deficiency and sensitivity to DNA damaging agents.

p16 is a tumor suppressor encoded by the CDKN2A gene whose expression is lost in ~50% of all human cancers. In its canonical role, p16 inhibits the G1-S phase cell cycle progression through suppression of cyclin dependent kinases. Interestingly, p16 also has roles in metabolic reprogramming, and we previously published that loss of p16 promotes nucleotide synthesis via the pentose phosphate pathway. Whether other nucleotide metabolic genes and pathways are affected by p16/CDKN2A loss and if these can be specifically targeted in p16/CDKN2A-low tumors has not been previously explored. Using CRISPR KO libraries in multiple isogenic human and mouse melanoma cell lines, we determined that many nucleotide metabolism genes are negatively enriched in p16/CDKN2A knockdown cells compared to controls. Indeed, many of the genes that are required for survival in the context of low p16/CDKN2A expression based on our CRISPR screens are upregulated in p16 knockdown melanoma cells and those with endogenously low CDKN2A expression. We determined that cells with low p16/Cdkn2a expression are sensitive to multiple inhibitors of de novo purine synthesis, including anti-folates. Tumors with p16 knockdown were more sensitive to the anti-folate methotrexate in vivo than control tumors. Together, our data provide evidence to reevaluate the utility of these drugs in patients with p16/CDKN2A-low tumors as loss of p16/CDKN2A may provide a therapeutic window for these agents.

Cancer stem cells (CSCs) are a small but critical cell population for cancer biology since they display inherent resistance to standard therapies and give rise to metastases. Despite accruing evidence establishing a link between deregulation of epitranscriptome-related players and tumorigenic process, the role of messenger RNA (mRNA) modifications dynamic in the regulation of CSC properties remains poorly understood. Here, we show that the cytoplasmic pool of fat mass and obesity-associated protein (FTO) impedes CSC abilities in colorectal cancer through its m6Am (N6,2'-O-dimethyladenosine) demethylase activity. While m6Am is strategically located next to the m7G-mRNA cap, its biological function is not well understood and has not been addressed in cancer. Low FTO expression in patient-derived cell lines elevates m6Am level in mRNA which results in enhanced in vivo tumorigenicity and chemoresistance. Inhibition of the nuclear m6Am methyltransferase, PCIF1/CAPAM, partially reverses this phenotype. FTO-mediated regulation of m6Am marking constitutes a novel, reversible pathway controlling CSC abilities that does not involve transcriptome remodeling, but could fine-tune translation efficiency of selected m6Am marked transcripts. Altogether, our findings bring to light the first biological function of the m6Am modification and its potential adverse consequences for colorectal cancer management.