A family of cloning vectors derived from plasmid pACYC184 and, therefore, compatible with pBR322 and its derivatives (especially the pUC family of vectors), is described. They all contain a multiple cloning site (MCS) and the lacZα reporter gene for easy cloning. They have been grouped in three sets: (i) six of the vectors contain a chloramphenicol-resistance (CmR)-encoding gene and each a different MCS with 16 unique restriction sites overall; (ii) another six vectors contain a kanamycin-resistance (KmR)-encoding gene and the same six MCS; and (iii) two CmR vectors that contain the SP6 and T7 promoters flanking the MCS and lacZα reporter gene of pUC18/19.

Horizontal gene transfer shapes the genomes of prokaryotes by allowing rapid acquisition of novel adaptive functions. Conjugation allows the broadest range and the highest gene transfer input per transfer event. While conjugative plasmids have been studied for decades, the number and diversity of integrative conjugative elements (ICE) in prokaryotes remained unknown. We defined a large set of protein profiles of the conjugation machinery to scan over 1,000 genomes of prokaryotes. We found 682 putative conjugative systems among all major phylogenetic clades and showed that ICEs are the most abundant conjugative elements in prokaryotes. Nearly half of the genomes contain a type IV secretion system (T4SS), with larger genomes encoding more conjugative systems. Surprisingly, almost half of the chromosomal T4SS lack co-localized relaxases and, consequently, might be devoted to protein transport instead of conjugation. This class of elements is preponderant among small genomes, is less commonly associated with integrases, and is rarer in plasmids. ICEs and conjugative plasmids in proteobacteria have different preferences for each type of T4SS, but all types exist in both chromosomes and plasmids. Mobilizable elements outnumber self-conjugative elements in both ICEs and plasmids, which suggests an extensive use of T4SS in trans. Our evolutionary analysis indicates that switch of plasmids to and from ICEs were frequent and that extant elements began to differentiate only relatively recently. According to the present results, ICEs are the most abundant conjugative elements in practically all prokaryotic clades and might be far more frequently domesticated into non-conjugative protein transport systems than previously thought. While conjugative plasmids and ICEs have different means of genomic stabilization, their mechanisms of mobility by conjugation show strikingly conserved patterns, arguing for a unitary view of conjugation in shaping the genomes of prokaryotes by horizontal gene transfer.

Bacterial conjugation in Gram-negative bacteria is triggered by a signal that connects the relaxosome to the coupling protein (T4CP) and transferosome, a type IV secretion system. The relaxosome, a nucleoprotein complex formed at the origin of transfer (oriT), consists of a relaxase, directed to the nic site by auxiliary DNA-binding proteins. The nic site undergoes cleavage and religation during vegetative growth, but this is converted to a cleavage and unwinding reaction when a competent mating pair has formed. Here, we review the biochemistry of relaxosomes and ponder some of the remaining questions about the nature of the signal that begins the process.

Third-generation cephalosporins are a class of β-lactam antibiotics that are often used for the treatment of human infections caused by Gram-negative bacteria, especially Escherichia coli. Worryingly, the incidence of human infections caused by third-generation cephalosporin-resistant E. coli is increasing worldwide. Recent studies have suggested that these E. coli strains, and their antibiotic resistance genes, can spread from food-producing animals, via the food-chain, to humans. However, these studies used traditional typing methods, which may not have provided sufficient resolution to reliably assess the relatedness of these strains. We therefore used whole-genome sequencing (WGS) to study the relatedness of cephalosporin-resistant E. coli from humans, chicken meat, poultry and pigs. One strain collection included pairs of human and poultry-associated strains that had previously been considered to be identical based on Multi-Locus Sequence Typing, plasmid typing and antibiotic resistance gene sequencing. The second collection included isolates from farmers and their pigs. WGS analysis revealed considerable heterogeneity between human and poultry-associated isolates. The most closely related pairs of strains from both sources carried 1263 Single-Nucleotide Polymorphisms (SNPs) per Mbp core genome. In contrast, epidemiologically linked strains from humans and pigs differed by only 1.8 SNPs per Mbp core genome. WGS-based plasmid reconstructions revealed three distinct plasmid lineages (IncI1- and IncK-type) that carried cephalosporin resistance genes of the Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL)- and AmpC-types. The plasmid backbones within each lineage were virtually identical and were shared by genetically unrelated human and animal isolates. Plasmid reconstructions from short-read sequencing data were validated by long-read DNA sequencing for two strains. Our findings failed to demonstrate evidence for recent clonal transmission of cephalosporin-resistant E. coli strains from poultry to humans, as has been suggested based on traditional, low-resolution typing methods. Instead, our data suggest that cephalosporin resistance genes are mainly disseminated in animals and humans via distinct plasmids.

Abstract Plasmids can mediate horizontal gene transfer of antibiotic resistance, virulence genes, and other adaptive factors across bacterial populations. Here, we analyze genomic composition and pairwise sequence identity for over 10,000 reference plasmids to obtain a global map of the prokaryotic plasmidome. Plasmids in this map organize into discrete clusters, which we call plasmid taxonomic units (PTUs), with high average nucleotide identity between its members. We identify 83 PTUs in the order Enterobacterales , 28 of them corresponding to previously described archetypes. Furthermore, we develop an automated algorithm for PTU identification, and validate its performance using stochastic blockmodeling. The algorithm reveals a total of 276 PTUs in the bacterial domain. Each PTU exhibits a characteristic host distribution, organized into a six-grade scale (I–VI), ranging from plasmids restricted to a single host species (grade I) to plasmids able to colonize species from different phyla (grade VI). More than 60% of the plasmids in the global map are in groups with host ranges beyond the species barrier.

Conjugation of DNA through a type IV secretion system (T4SS) drives horizontal gene transfer. Yet little is known on the diversity of these nanomachines. We previously found that T4SS can be divided in eight classes based on the phylogeny of the only ubiquitous protein of T4SS (VirB4). Here, we use an ab initio approach to identify protein families systematically and specifically associated with VirB4 in each class. We built profiles for these proteins and used them to scan 2262 genomes for the presence of T4SS. Our analysis led to the identification of thousands of occurrences of 116 protein families for a total of 1623 T4SS. Importantly, we could identify almost always in our profiles the essential genes of well-studied T4SS. This allowed us to build a database with the largest number of T4SS described to date. Using profile–profile alignments, we reveal many new cases of homology between components of distant classes of T4SS. We mapped these similarities on the T4SS phylogenetic tree and thus obtained the patterns of acquisition and loss of these protein families in the history of T4SS. The identification of the key VirB4-associated proteins paves the way toward experimental analysis of poorly characterized T4SS classes.

The Plasmid Taxonomic Unit (PTU) concept is an initial step for a natural classification of plasmids. Here we present COPLA, a software for plasmid assignation to existing PTUs. To assess its performance, we used a sample of 1,000 plasmids missing from its current database. Overall, 41% of samples could be assigned an existing PTU (63% within the most abundant order, Enterobacterales ), while 4% of samples could help to define new PTUs once COPLA database was updated.

ABSTRACT Plasmid conjugation is a major route for the dissemination of antibiotic resistances and adaptive genes among bacterial populations. Obtaining precise conjugation rates is thus key to understanding how antibiotic resistances spread. Plasmid conjugation is typically modeled as a density-dependent process, where the formation of new transconjugants is proportional to the rate of encounters between donor and recipient bacteria. By analyzing conjugation dynamics at different cell concentrations, here we show that this assumption only holds at low bacterial densities. At higher concentrations, plasmid transmission switches from a density-dependent process to a frequency-dependent one. Mathematical modeling revealed that plasmid conjugation follows a Hollinǵs Type II functional response, characterized by two fundamental parameters: the searching rate and the handling time. These parameters represent, respectively, the density and frequency dependent limits for plasmid transmission. Our results demonstrate that these parameters are characteristic of the transfer machinery, rather than the entire plasmid genome, and that they are robust to environmental and transcriptional perturbation. Precise parameterization of plasmid conjugation will contribute to a better understanding of the propagation dynamics of antimicrobial resistances.

ABSTRACT Circadian clocks synchronize internal cellular states with diurnal rhythms. Widespread in bacteria and eukaryotes, they regulate a variety of physiological processes, from hormone secretion in animals to carbon fixation in photosynthetic organisms. The adaptive role of circadian clocks is assumed to stem from their ability to anticipate environmental change, yet their impact on ecological adaptation remains unclear. Here, we use experimental evolution to study the interplay between fitness and circadian regulation in the model cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. After 1,200 generations under continuous, high-intensity illumination, we obtained a strain that grew six times faster than its ancestral counterpart. Genome sequencing revealed three mutations fixed in the population, two of which replicated the fast-growing phenotype in the wild-type. A deletion in SasA, a key circadian regulator, was essential for fast growth. Transcriptomic and metabolomic analyses revealed that this mutation perturbed the rhythmicity of the cycle, while simultaneously locking the cell in a transcriptomic response to high intensity illumination. A comparison with another fast- growing isolate, UTEX 2973, showed convergent transcriptomic states despite different driving mutations. Our results indicate that the clock acts not only as a timekeeping device, but also as an adaptive mechanism to optimize growth across diverse ecological conditions.

Bacterial relatedness measured using select chromosomal loci forms the basis of public health genomic surveillance. While approximating vertical evolution through this approach has proven exceptionally valuable for understanding pathogen dynamics, it excludes a fundamental dimension of bacterial evolution-horizontal gene transfer. Incorporating the accessory genome is the logical remediation and has recently shown promise in expanding epidemiological resolution for enteric pathogens. Employing