Opium is one of the world's oldest drugs, and its derivatives morphine and codeine are among the most used clinical drugs to relieve severe pain. These prototypical opioids produce analgesia as well as many undesirable side effects (sedation, apnoea and dependence) by binding to and activating the G-protein-coupled µ-opioid receptor (µ-OR) in the central nervous system. Here we describe the 2.8 Å crystal structure of the mouse µ-OR in complex with an irreversible morphinan antagonist. Compared to the buried binding pocket observed in most G-protein-coupled receptors published so far, the morphinan ligand binds deeply within a large solvent-exposed pocket. Of particular interest, the µ-OR crystallizes as a two-fold symmetrical dimer through a four-helix bundle motif formed by transmembrane segments 5 and 6. These high-resolution insights into opioid receptor structure will enable the application of structure-based approaches to develop better drugs for the management of pain and addiction.

Activation of the μ-opioid receptor (μOR) is responsible for the efficacy of the most effective analgesics. To shed light on the structural basis for μOR activation, here we report a 2.1 Å X-ray crystal structure of the murine μOR bound to the morphinan agonist BU72 and a G protein mimetic camelid antibody fragment. The BU72-stabilized changes in the μOR binding pocket are subtle and differ from those observed for agonist-bound structures of the β2-adrenergic receptor (β2AR) and the M2 muscarinic receptor. Comparison with active β2AR reveals a common rearrangement in the packing of three conserved amino acids in the core of the μOR, and molecular dynamics simulations illustrate how the ligand-binding pocket is conformationally linked to this conserved triad. Additionally, an extensive polar network between the ligand-binding pocket and the cytoplasmic domains appears to play a similar role in signal propagation for all three G-protein-coupled receptors. X-ray crystallography and molecular dynamics simulations of the μ-opioid receptor reveal the conformational changes in the extracellular and intracellular domains of this G-protein-coupled receptor that are associated with its activation. The μ-opioid receptor is a G-protein-coupled receptor (GPCR) activated by various analgesics, endogenous endorphins and drugs of abuse such as heroin and opium. Our understanding of the mechanism by which agonist binding leads to recognition, coupling, and activation of a particular G protein subtype is incomplete. In two papers in this issue of Nature, the authors used X-ray crystallography, molecular dynamics simulations, and NMR spectroscopy to probe the structural basis for receptor activation. As well as revealing the conformational changes in the extracellular and intracellular domains of this GPCR associated with receptor activation, these studies help explain why the allosteric coupling between the agonist-binding pocket and the cytoplasmic G-protein-coupling interface of this receptor is relatively weak.

The X-ray crystal structure of the mouse δ-opioid receptor in complex with the subtype-selective antagonist naltrindole is reported. Four papers in this issue of Nature present the long-awaited high-resolution crystal structures of the four known opioid receptors in ligand-bound conformations. These G-protein-coupled receptors are the targets of a broad range of drugs, including painkillers, antidepressants, anti-anxiety agents and anti-addiction medications. Brian Kobilka’s group reports the crystal structure of the µ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist and the δ-opioid receptor bound to naltrindole. Raymond Stevens’ group reports on the κ-opioid receptor bound to the selective antagonist JDTic, and the nociceptin/orphanin FQ receptor bound to a peptide mimetic. In an associated News and Views, Marta Filizola and Lakshmi Devi discuss the implications of these landmark papers for research on the mechanisms underlying receptor function and drug development. The opioid receptor family comprises three members, the µ-, δ- and κ-opioid receptors, which respond to classical opioid alkaloids such as morphine and heroin as well as to endogenous peptide ligands like endorphins. They belong to the G-protein-coupled receptor (GPCR) superfamily, and are excellent therapeutic targets for pain control. The δ-opioid receptor (δ-OR) has a role in analgesia, as well as in other neurological functions that remain poorly understood1. The structures of the µ-OR and κ-OR have recently been solved2,3. Here we report the crystal structure of the mouse δ-OR, bound to the subtype-selective antagonist naltrindole. Together with the structures of the µ-OR and κ-OR, the δ-OR structure provides insights into conserved elements of opioid ligand recognition while also revealing structural features associated with ligand-subtype selectivity. The binding pocket of opioid receptors can be divided into two distinct regions. Whereas the lower part of this pocket is highly conserved among opioid receptors, the upper part contains divergent residues that confer subtype selectivity. This provides a structural explanation and validation for the ‘message–address’ model of opioid receptor pharmacology4,5, in which distinct ‘message’ (efficacy) and ‘address’ (selectivity) determinants are contained within a single ligand. Comparison of the address region of the δ-OR with other GPCRs reveals that this structural organization may be a more general phenomenon, extending to other GPCR families as well.

The μ-opioid receptor (μOR) is a G-protein-coupled receptor (GPCR) and the target of most clinically and recreationally used opioids. The induced positive effects of analgesia and euphoria are mediated by μOR signalling through the adenylyl cyclase-inhibiting heterotrimeric G protein Gi. Here we present the 3.5 Å resolution cryo-electron microscopy structure of the μOR bound to the agonist peptide DAMGO and nucleotide-free Gi. DAMGO occupies the morphinan ligand pocket, with its N terminus interacting with conserved receptor residues and its C terminus engaging regions important for opioid-ligand selectivity. Comparison of the μOR–Gi complex to previously determined structures of other GPCRs bound to the stimulatory G protein Gs reveals differences in the position of transmembrane receptor helix 6 and in the interactions between the G protein α-subunit and the receptor core. Together, these results shed light on the structural features that contribute to the Gi protein-coupling specificity of the µOR. A cryo-electron structure of the µ-opioid receptor in complex with the peptide agonist DAMGO and the inhibitory G protein Gi reveals structural determinants of its G protein-binding specificity.

We have designed a microfluidic device in which we can manipulate, lyse, label, separate, and quantify the protein contents of a single cell using single-molecule fluorescence counting. Generic labeling of proteins is achieved through fluorescent-antibody binding. The use of cylindrical optics enables high-efficiency (≈60%) counting of molecules in micrometer-sized channels. We used this microfluidic device to quantify β 2 adrenergic receptors expressed in insect cells (SF9). We also analyzed phycobiliprotein contents in individual cyanobacterial cells ( Synechococcus sp. PCC 7942) and observed marked differences in the levels of specific complexes in cell populations that were grown under nitrogen-depleted conditions.

NMR spectroscopy reveals the conformational changes of the μ-opioid receptor that are associated with receptor activation, helping to explain why the allosteric coupling between the agonist-binding pocket and the cytoplasmic G-protein-coupling interface of this receptor is relatively weak. The μ-opioid receptor is a G-protein-coupled receptor (GPCR) activated by various analgesics, endogenous endorphins and drugs of abuse such as heroin and opium. Our understanding of the mechanism by which agonist binding leads to recognition, coupling, and activation of a particular G protein subtype is incomplete. In two papers in this issue of Nature, the authors used X-ray crystallography, molecular dynamics simulations, and NMR spectroscopy to probe the structural basis for receptor activation. As well as revealing the conformational changes in the extracellular and intracellular domains of this GPCR associated with receptor activation, these studies help explain why the allosteric coupling between the agonist-binding pocket and the cytoplasmic G-protein-coupling interface of this receptor is relatively weak. µ-Opioid receptors (µORs) are G-protein-coupled receptors that are activated by a structurally diverse spectrum of natural and synthetic agonists including endogenous endorphin peptides, morphine and methadone. The recent structures of the μOR in inactive1 and agonist-induced active states (Huang et al., ref. 2) provide snapshots of the receptor at the beginning and end of a signalling event, but little is known about the dynamic sequence of events that span these two states. Here we use solution-state NMR to examine the process of μOR activation using a purified receptor (mouse sequence) preparation in an amphiphile membrane-like environment. We obtain spectra of the μOR in the absence of ligand, and in the presence of the high-affinity agonist BU72 alone, or with BU72 and a G protein mimetic nanobody. Our results show that conformational changes in transmembrane segments 5 and 6 (TM5 and TM6), which are required for the full engagement of a G protein, are almost completely dependent on the presence of both the agonist and the G protein mimetic nanobody, revealing a weak allosteric coupling between the agonist-binding pocket and the G-protein-coupling interface (TM5 and TM6), similar to that observed for the β2-adrenergic receptor3. Unexpectedly, in the presence of agonist alone, we find larger spectral changes involving intracellular loop 1 and helix 8 compared to changes in TM5 and TM6. These results suggest that one or both of these domains may play a role in the initial interaction with the G protein, and that TM5 and TM6 are only engaged later in the process of complex formation. The initial interactions between the G protein and intracellular loop 1 and/or helix 8 may be involved in G-protein coupling specificity, as has been suggested for other family A G-protein-coupled receptors.

Abstract Atypical Chemokine Receptor 3 (ACKR3) is a G protein-coupled receptor that does not signal through G proteins. It is known as a chemokine scavenger involved in various pathologies, making it an appealing yet intriguing therapeutic target. Indeed, the structural properties that govern ACKR3 functional selectivity and the overall conformational dynamics of ACKR3 activation are poorly understood. Here we combined Hydrogen/Deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) and molecular dynamics simulations to examine the binding mode and mechanism of action of various small-molecule ACKR3 ligands of different efficacy for β-arrestin recruitment. Our results show that activation or inhibition of ACKR3 is largely governed by intracellular conformational changes of helix 6, intracellular loop 2 and helix 7, while the DRY motif becomes protected during both processes. Moreover, HDX-MS identifies the binding sites and the allosteric modulation of ACKR3 upon β-arrestin 1 binding. In summary, this study highlights the structure-function relationship of small-molecule ligands, the overall activation dynamics of ACKR3, the binding mode of β-arrestin 1 and the atypical dynamic features in ACKR3 that may contribute to its inability to activate G proteins.

Atypical Chemokine Receptor 3 (ACKR3) belongs to the G protein-coupled receptor family but it does not signal through G proteins. The structural properties that govern the functional selectivity and the conformational dynamics of ACKR3 activation are poorly understood. Here, we combined hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, site-directed mutagenesis, and molecular dynamics simulations to examine the binding mode and mechanism of action of ACKR3 ligands of different efficacies. Our results show that activation or inhibition of ACKR3 is governed by intracellular conformational changes of helix 6, intracellular loop 2, and helix 7, while the DRY motif becomes protected during both processes. Moreover, we identified the binding sites and the allosteric modulation of ACKR3 upon β-arrestin 1 binding. In summary, this study highlights the structure-function relationship of small ligands, the binding mode of β-arrestin 1, the activation dynamics, and the atypical dynamic features in ACKR3 that may contribute to its inability to activate G proteins.

Abstract Arrestins interact with G protein-coupled receptors (GPCRs) to stop G protein activation and to initiate key signaling pathways. Recent structural studies shed light on the molecular mechanisms involved in GPCR-arrestin coupling, but whether this process is conserved among GPCRs is poorly understood. Here, we report the cryo-electron microscopy active structure of the wild-type arginine-vasopressin V2 receptor (V2R) in complex with β-arrestin1. It reveals an atypical position of β-arrestin1 compared to previously described GPCR-arrestin assemblies, associated with an original V2R/β-arrestin1 interface involving all receptor intracellular loops. Phosphorylated sites of the V2R C-terminus are clearly identified and interact extensively with the β-arrestin1 N-lobe, in agreement with structural data obtained with chimeric or synthetic systems. Overall, these findings highlight a striking structural variability among GPCR-arrestin signaling complexes.

SUMMARY GPCR functional selectivity has opened new opportunities for the design of safer drugs. Ligands orchestrate GPCR signaling cascades by modulating the receptor conformational landscape. Our study provides insights into the dynamic mechanism enabling opioid ligands to preferentially activate the G protein over the β-arrestin pathways through the μ-opioid receptor (μOR). We combined functional assays in living cells, solution NMR spectroscopy and enhanced-sampling molecular dynamic simulations to identify the specific μOR conformations induced by G protein-biased agonists. In particular, we describe the dynamic and allosteric communications between the ligand-binding pocket and the receptor intracellular domains, through conserved motifs in class A GPCRs. Most strikingly, the biased agonists triggered μOR conformational changes in the intracellular loop 1 and helix 8 domains, which may impair β-arrestin binding or signaling. The findings may apply to other GPCR families and provide key molecular information that could facilitate the design of biased ligands.