The identification of cell-type-specific 3D chromatin interactions between regulatory elements can help to decipher gene regulation and to interpret the function of disease-associated non-coding variants. However, current chromosome conformation capture (3C) technologies are unable to resolve interactions at this resolution when only small numbers of cells are available as input. We therefore present ChromaFold, a deep learning model that predicts 3D contact maps and regulatory interactions from single-cell ATAC sequencing (scATAC-seq) data alone. ChromaFold uses pseudobulk chromatin accessibility, co-accessibility profiles across metacells, and predicted CTCF motif tracks as input features and employs a lightweight architecture to enable training on standard GPUs. Once trained on paired scATAC-seq and Hi-C data in human cell lines and tissues, ChromaFold can accurately predict both the 3D contact map and peak-level interactions across diverse human and mouse test cell types. In benchmarking against a recent deep learning method that uses bulk ATAC-seq, DNA sequence, and CTCF ChIP-seq to make cell-type-specific predictions, ChromaFold yields superior prediction performance when including CTCF ChIP-seq data as an input and comparable performance without. Finally, fine-tuning ChromaFold on paired scATAC-seq and Hi-C in a complex tissue enables deconvolution of chromatin interactions across cell subpopulations. ChromaFold thus achieves state-of-the-art prediction of 3D contact maps and regulatory interactions using scATAC-seq alone as input data, enabling accurate inference of cell-type-specific interactions in settings where 3C-based assays are infeasible.

Abstract Although CAR-T19 therapy is widely used for relapsed/refractory B cell lymphomas, approximately half of patients experience post CAR-T relapse. The mechanisms underlying this resistance remain largely unknown and efforts to overcome this limitation are hindered by the lack of suitable pre-clinical models for study. To address these unmet needs, we generated a novel genetically engineered mouse model with conditional expression of Ezh2Y641F and BCL2 in germinal center (GC) B cells. Ezh2/BCL2 mice developed follicular lymphoma (FL) which histologically and transcriptionally recapitulates human FL. Moreover, we established a cell line derived from an Ezh2/BCL2 mouse that developed transformed FL (tFL). Injection of the cell line named “tFL-P6” in immunocompetent C57BL6 recipients resulted in rapid disease progression that histologically and transcriptionally mimics human tFL. Treatment of tFL-P6 with EZH2 inhibitors (EZH2i) didn’t affect proliferation and viability, however, the number of pretreated cells was significantly reduced when co-cultured with T cells. EZH2i pretreated tFL-P6 displayed extended interaction with T cells, as measured by live imaging. EZH2i reprogrammed tFL-P6 to restore T cell engagement genes such as ICOSL, ICAM1, OX40L, and integrins, as well as cytokines and chemokines involved in T cell recruitment, therefore enhancing immunogenicity. Notably, pretreated tFL-P6 cells were rejected by C57BL6 whereas they developed lethal disease in immunodeficient recipients. Pre-treatment of tFL-P6 as well as human DLBCL and PDX-derived cell lines significantly enhanced CAR-T19 cell killing effects in vitro. Administering CAR-T cells in mice engrafted with EZH2i-pretreated tFL-P6 significantly reduced the tumor burden and prolonged their survival (100% vs 30%, p<0.01). To assess the direct interactions between lymphoma cells and CAR-T cells in vivo, we performed intravital 2-photon imaging of popliteal lymph nodes using dTomato labeled CAR-T cells and GFP+ tFL-P6 cells. Pretreatment of tFL-P6 cells with EZH2i doubled the recruitment of CAR-T cells in the microenvironment and enhanced the duration of contact and surface engagement with CAR-T cells. To explore the impact of EZH2 inhibition on CAR-T cells, we manufactured CAR-T cells from splenic T cells of mice treated with EZH2i or vehicle for 14 days. Prior exposure to EZH2i didn’t affect proliferation and transduction during CAR-T production. Ex vivo assays with those CAR-T cells and tFL-P6 cells showed a superior killing effect and expansion of EZH2i-exposed CAR-T (p<0.001). Mice bearing tFL-P6 lymphomas displayed a longer survival when infused with EZH2i-pretreated CAR-T cells (p=0.06). Pretreatment with EZH2i resulted in an increased memory/effector ratio (p<0.01) and reduction of PD1+CD38+ exhausted CD8CAR-T cells (p<0.001). Overall, EZH2i improved CAR-T therapy by enhancing lymphoma cell immunogenicity and CAR-T cell functions. These results prompted the initiation of a clinical trial to evaluate the safety and efficacy of this combination in R/R B cell lymphomas (NCT05934838). Citation Format: Yusuke Isshiki, Xi Chen, Matt Teater, Ioannis Karagiannidis, Henna Nam, Amy Chadburn, Ari Melnick, Wendy Béguelin. EZH2 inhibitors improve CAR-T therapy by enhancing lymphoma B cell immunogenicity and CAR-T cell functions [abstract]. In: Proceedings of the Fourth AACR International Meeting on Advances in Malignant Lymphoma: Maximizing the Basic-Translational Interface for Clinical Application; 2024 Jun 19-22; Philadelphia, PA. Philadelphia (PA): AACR; Blood Cancer Discov 2024;5(3_Suppl):Abstract nr PR01.

Abstract Diffuse large B cell lymphomas and follicular lymphomas show recurrent mutations in epigenetic regulators; among these are loss-of-function mutations in KMT2D and gain-of-function mutations in EZH2. To systematically explore the effects of these mutations on the wiring of the epigenetic network, we applied a single-cell approach to probe a wide array of histone modifications. We show that mutant-EZH2 elicits extensive effects on the epigenome of lymphomas, beyond alterations to H3K27 methylations, and is dominant over KMT2D mutations. Utilizing the single-cell data, we present computational methods to measure epigenetic heterogeneity. We identify an unexpected characteristic of mutant-EZH2, but not KMT2D, in increasing heterogeneity, shedding light on a novel oncogenic mechanism mediated by this mutation. Finally, we present tools to reconstruct known interactions within the epigenetic network, as well as reveal potential novel cross talk between various modifications, validated by functional perturbations. Our work highlights novel roles for mutant-EZH2 in lymphomagenesis and establishes new concepts for measuring epigenetic heterogeneity and intra-chromatin connectivity in cancer cells.