Summary Daptomycin is a last-line antibiotic commonly used to treat vancomycin resistant Enterococci, but resistance evolves rapidly and further restricts already limited treatment options. While genetic determinants associated with clinical daptomycin resistance (DAP R ) have been described, information on factors affecting the speed of DAP R acquisition is limited. The multiple peptide resistance factor (MprF), a phosphatidylglycerol modifying enzyme involved in cationic antimicrobial resistance, is linked to DAP R in pathogens such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus . Since Enterococcus faecalis encodes two paralogs of mprF and clinical DAP R mutations do not map to mprF, we hypothesized that functional redundancy between the paralogs prevents mprF -mediated resistance and masks other evolutionary pathways to DAP R . Here we performed in vitro evolution to DAP R in mprF mutant background. We discovered that the absence of mprF results in slowed DAP R evolution and is associated with inactivating mutations in ftsH resulting in the depletion of the chaperone repressor HrcA. We also report that ftsH is essential in the parental, but not in the Δ mprF , strain where FtsH depletion results in growth impairment in the parental strain, a phenotype associated with reduced glycolysis and reduced ability for metabolic reduction. This presents FtsH and HrcA as enticing targets for developing anti-resistance strategies. Graphical Abstract

Abstract Objective Gastric cancer (GC) tumors are highly heterogenous with different subpopulations of epithelial cells. We employed single cell RNA sequencing (scRNA-seq) to dissect the heterogeneity and identified subpopulations of cancer cells with stem-like properties. We further investigated their resistance to oxaliplatin chemotherapy and their contribution to gastric cancer outcome. Design We performed scRNA-seq on FACS sorted epithelial and immune cells from paired samples of GC tumors and normal adjacent tissues. We identified two epithelial subpopulations (STMN1 + IQGAP3 + and STMN1 + IQGAP3 − ) with stem-like properties. We characterized and compared them to known healthy gastric stem cell populations. We also cultivated GC derived organoids to study the chemoresistance of similarly marked populations. Lastly, we employed immunohistochemistry (IHC) staining to ascertain the predicted immunosuppressive interactions. Results The STMN1 + IQGAP3 + subpopulation showed a higher tumor mutation burden, upregulated proliferative pathways and transcriptomically resembled proliferative healthy gastric isthmus stem cells. The STMN1 + IQGAP3 − subpopulation were comparatively quiescent and transcriptomically resembled enteroendocrine cells. Both transcriptomic signatures were associated with worse mortality than other epithelial subpopulations with the quiescent being associated with the poorest patient survival. GC tissue derived organoids were dominated by STMN1 + IQGAP3 + cells but the STMN1 + IQGAP3 − compartment was more resistant to chemotherapy. We also verified the likely suppression of CD8 T cell cytotoxicity by STMN1 + IQGAP3 + cells through the NECTIN2/TIGIT interaction. Conclusions Cancer cells with stem-like characteristics are associated with poor survival through chemoresistance and immunosuppression. Reactivating the immune system through checkpoint blockade is an opportunity to eliminate these cells. What is already known on this topic Multiple gastric stem cell populations have been identified and linked to tumor initiation in rodent-based studies. However, none of them have been conclusively proven in human tumors. Isolating and characterizing tumor cells with stem-like properties will help shed light on their possible origin and possible mitigation strategies. What this study adds Here we identified two sets of stem-like gastric cancer cells that are associated with poorer patient prognosis. One set is highly proliferative and exhibits oxaliplatin susceptibility. It also engages in immunosuppressive interactions such as NECTIN2/TIGIT. The other set is quiescent and highly resistant to oxaliplatin. How this study might affect research, practice or policy The transcriptome signatures of the identified stem-like cells can aid in patient prognosis and identify patients who can benefit from checkpoint blockade therapy to reactivate their immune response towards gastric cancer cells.

Abstract Enterococcus faecalis is a frequent opportunistic pathogen of wounds, whose infections are associated with biofilm formation, persistence, and recalcitrance toward treatment. We have previously shown that E. faecalis wound infection persists for at least 7 days. Here we report that viable E. faecalis are present within both immune and non-immune cells at the wound site up to 5 days after infection, raising the prospect that intracellular persistence contributes to chronic E. faecalis infection. Using an in vitro keratinocyte infection model, we show that a subpopulation of E. faecalis becomes internalized via macropinocytosis into single membrane-bound compartments, where they can survive and replicate. These intracellular E. faecalis can persist in late endosomes up to 72 hours after infection in the absence of colocalization with the lysosomal protease cathepsin D or apparent fusion with the lysosome, suggesting that E. faecalis blocks endosomal maturation. Indeed, intracellular E. faecalis infection results in a marked reduction in Rab7 expression, a small GTPase required for endosome-lysosome fusion. Finally, we demonstrate that intracellular E. faecalis derived from infected keratinocytes are significantly more efficient in reinfecting new keratinocytes. Together, these data suggest that intracellular proliferation of E. faecalis may contribute to its persistence in the face of a robust immune response, providing a primed reservoir of bacteria for subsequent reinfection. Author Summary Enterococcus faecalis is often isolated from chronic wounds. Prior to this study, E. faecalis has been observed within different cell types, suggesting that it can successfully colonize intracellular spaces. However, to date, little is known about the mechanisms E. faecalis use to survive intracellularly. Here, we describe key features of the intracellular lifestyle of E. faecalis . We show that E. faecalis exists in an intracellular state within immune cells and non-immune cells during mammalian wound infection. We show that E. faecalis can survive and replicate inside keratinocytes, and intracellularly replicating E. faecalis are primed to more efficiently cause reinfection, potentially contributing to chronic or persistent infections. In order to establish this intracellular lifestyle, E. faecalis is taken up by keratinocytes via macropinocytosis, whereupon it manipulates the endosomal pathway and expression of trafficking molecules required for endo-lysosomal fusion, enabling E. faecalis to avoid lysosomal degradation and consequent death. These results advance our understanding of E. faecalis pathogenesis, demonstrating mechanistically how this classic extracellular pathogen can co-opt host cells for intracellular persistence, and highlight the heterogeneity of mechanisms bacteria can use to avoid host-mediated killing in order to cause disease.

Enterococcus faecalis is a member of the human gastrointestinal microbiota and is an opportunistic pathogen associated with hospital-acquired infections (HAIs) of wounds, the bloodstream, and the urinary tract. E. faecalis has the ability to subvert or evade immune-mediated clearance, although the mechanisms underlying this are poorly understood. In this study, we examine the ability of E. faecalis to subvert macrophage activation. We show that E. faecalis actively prevents NF-κB driven signaling in mouse RAW264.7 macrophages both in the presence of Toll-like receptor agonists and during polymicrobial infection with Escherichia coli. Co-infection with E. faecalis and E. coli in a mouse model of catheter-associated urinary tract infection (CAUTI) results in a reduced macrophage transcriptional response in the bladder compared to E. coli infection alone. Finally, we demonstrate that co-inoculation of E. faecalis with E. coli into the catheterized bladder significantly augments E. coli CAUTI. Taken together, these results implicate E. faecalis suppression of NF-κB-driven responses in macrophages with polymicrobial CAUTI pathogenesis.

Group A Streptococcus (GAS) is a human pathogen that causes infections ranging from mild to fulminant and life-threatening. Biofilms have been implicated in acute GAS soft-tissue infections such as necrotizing fasciitis (NF). However, most in vitro models used to study GAS biofilms have been designed to mimic chronic infections and insufficiently recapitulate in vivo conditions and the host-pathogen interactions that might influence biofilm formation. Here we establish and characterize an in vitro model of GAS biofilm development on mammalian cells that simulates microcolony formation observed in a murine model of human NF. We show that on mammalian cells, GAS forms dense aggregates that display hallmark biofilm characteristics including a three-dimensional architecture and enhanced tolerance to antibiotics. In contrast to abiotic-grown biofilms, host-associated biofilms require the expression of secreted GAS streptolysins O and S (SLO, SLS) resulting in the release of a host-associated biofilm promoting-factor(s). Supernatants from GAS-infected mammalian cells or from cells treated with endoplasmic reticulum (ER) stressors restore biofilm formation to an SLO and SLS null mutant that is otherwise attenuated in biofilm formation on cells, together suggesting a role for streptolysin-induced ER stress in this process. In an in vivo mouse model, the streptolysin-null mutant is attenuated in both microcolony formation and bacterial spread, but pre-treatment of soft-tissue with an ER-stressor restores the ability of the mutant to form wild type like microcolonies that disseminate throughout the soft tissue. Taken together, we have identified a new role of streptolysin-driven ER stress in GAS biofilm formation and NF disease progression.

Summary Wound infections are often polymicrobial in nature and are associated with poor disease prognoses. Escherichia coli and Staphylococcus aureus are among the top five most cultured pathogens from wound infections. However, little is known about the polymicrobial interactions between E. coli and S. aureus during wound infections. In this study, we show that E. coli kills S. aureus both in vitro and in a mouse excisional wound model via the genotoxin, colibactin. We also show that the BarA-UvrY two component system (TCS) is a novel regulator of the pks island, which acts through the carbon storage global regulatory (Csr) system. Together, our data demonstrate the role of colibactin in inter-species competition and show that it is regulated by BarA-UvrY TCS, a previously uncharacterized regulator of the pks island.

Enterococcus faecalis is one of most frequently isolated bacterial species in wounds yet little is known about its pathogenic mechanisms in this setting. Here, we used a mouse wound excisional model to characterize the infection dynamics of E. faecalis and show that infected wounds result in two different states depending on the initial inoculum. Low dose inocula were associated with short term, low titer colonization whereas high dose inocula were associated with acute bacterial replication and long term persistence. High dose infection and persistence were also associated with immune cell infiltration, despite suppression of some inflammatory cytokines and delayed wound healing. During high dose infection, the multiple peptide resistance factor (MprF) which is involved in resisting immune clearance, contributes to E. faecalis fitness. These results comprehensively describe a mouse model for investigating E. faecalis wound infection determinants, and suggest that both immune modulation and resistance contribute to persistent, non-healing wounds.

Sortase-assembled pili contribute to virulence in many Gram-positive bacteria. In Enterococcus faecalis, the endocarditis and biofilm-associated pilus (Ebp) is polymerized on the membrane by sortase C (SrtC) and attached to the cell wall by sortase A (SrtA). In the absence of SrtA, polymerized pili remain anchored to the membrane (i.e. off-pathway). Here we show that the high temperature requirement A (HtrA) bifunctional chaperone/protease of E. faecalis is a quality control system that clears aberrant off-pathway pili from the cell membrane. In the absence of HtrA and SrtA, accumulation of membrane-bound pili leads to cell envelope stress and partially induces the regulon of the ceftriaxone resistance-associated CroRS two-component system, which in turn causes hyper-piliation and cell morphology alterations. Inactivation of croR in the OG1RF ΔsrtAΔhtrA background partially restores the observed defects of the ΔsrtAΔhtrA strain, supporting a role for CroRS in the response to membrane perturbations. Moreover, absence of SrtA and HtrA decreases basal resistance of E. faecalis against cephalosporins and daptomycin. The link between HtrA, pilus biogenesis and the CroRS two-component system provides new insights into the E. faecalis response to endogenous membrane perturbations.

Abstract Spatial transcriptomics enable us to dissect tissue heterogeneity and map out inter-cellular communications. Optimal integration of transcriptomics data and associated spatial information is essential towards fully exploiting the data. We present SEDR, an unsupervised spatially embedded deep representation of both transcript and spatial information. The SEDR pipeline uses a deep autoencoder to construct a low-dimensional latent representation of gene expression, which is then simultaneously embedded with the corresponding spatial information through a variational graph autoencoder. We applied SEDR on human dorsolateral prefrontal cortex data and achieved better clustering accuracy, and correctly retraced the prenatal cortex development order with trajectory analysis. We also found the SEDR representation to be eminently suited for batch integration. Applying SEDR to human breast cancer data, we discerned heterogeneous sub-regions within a visually homogenous tumor region, identifying a tumor core with pro-inflammatory microenvironment and an outer ring region enriched with tumor associated macrophages which drives an immune suppressive microenvironment.

Abstract Enterococcus faecalis is an opportunistic pathogen that is frequently co-isolated with other microbes in catheterized urinary tract infections and chronically infected wounds. While E. faecalis can subvert the host immune response and promote the survival of other microbes via interbacterial synergy, little is known about the impact of immune suppression mediated by E. faecalis and how E. faecalis impacts the survival of co-infecting microbes. We hypothesized that E. faecalis can attenuate neutrophil-mediated responses in mixed-species infection to promote survival of the co-infecting species. Here, we show that E. faecalis and Staphylococcus aureus mono-species infection activates intracellular ROS production and NET formation, respectively, enabling effective neutrophil-mediated control of the microbial infection. Growth of both bacterial species was enhanced during co-infection in neutrophils in vitro and in wounds in vivo. E. faecalis reduced S. aureus -induced NET formation and S. aureus suppressed E. faecalis- induced intracellular ROS production. When the species ratios were skewed, the neutrophil reaction profile resembled that elicited by the more abundant species, favoring enhanced survival of the less abundant species. These findings highlight the complexity of the immune response to polymicrobial infections and show that attenuated pathogen-specific immune responses contribute to microbial survival in the mammalian host.