Abstract Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a medically important flavivirus that poses a significant health threat in Europe and Asia. However, the structure of the immature form of TBEV remains unknown. Here, we employed state-of-the-art cryogenic electron microscopy (cryoEM) to determine the structure of the immature TBEV particle. The immature TBEV particle has a diameter of 56 nm and its surface glycoproteins are organised into spikes characteristic of immature flaviviruses. The cryoEM reconstructions of the whole virus and of the individual spike enabled us to build atomic models of the major viral components, the E and prM proteins. The insights obtained from our study provide a foundation for understanding the early stages of TBEV assembly and maturation. The pr domains of prM have a critical role in holding the heterohexameric prM3E3 spikes in metastable conformation. Destabilisation of the prM furin-sensitive loop at acidic pH facilitates its processing. The prM cleavage, the collapse of E protein ectodomains onto the virion surface concurrent with significant movement of the membrane domains of both E and M, and release of the pr fragment from the particle render the virus mature and infectious. This knowledge contributes to our understanding of the flavivirus life cycle.

Abstract The SorC family of transcriptional regulators plays a crucial role in controlling the carbohydrate metabolism and quorum sensing. We employed an integrative approach combining X-ray crystallography and cryo-electron microscopy to investigate architecture and functional mechanism of two prototypical representatives of two sub-classes of the SorC family: DeoR and CggR from Bacillus subtilis. Despite possessing distinct DNA-binding domains, both proteins form similar tetrameric assemblies when bound to their respective DNA operators. Structural analysis elucidates the process by which the CggR-regulated gapA operon is derepressed through the action of two effectors: fructose-1,6-bisphosphate and newly confirmed dihydroxyacetone phosphate. Our findings provide the first comprehensive understanding of the DNA binding mechanism of the SorC-family proteins, shedding new light on their functional characteristics.

Abstract Mammalian Dicer is the gatekeeper into the essential gene-regulating miRNA pathway. What is committing mammalian Dicer to the miRNA pathway remains unknown. We report that Dicer’s highly conserved DExD/H helicase domain is the key structural element supporting accurate miRNA biogenesis. While ATPase activity of the domain is non-essential, its loss is lethal in mice. It is required during canonical miRNA biogenesis for efficient recognition, high-fidelity cleavage, and strand selection. Structure of Dicer-miRNA precursor complexes showed that the DExD/H domain acquired helicase-unrelated function defining Dicer conformations, which affect substrate loading and facilitate pre-selection of miRNA precursors. Dicer lacking the DExD/H domain favors conformations enabling reduced substrate selectivity and supporting RNA interference, a different small RNA pathway. Therefore, Dicer’s DExD/H domain ensures indispensable high-fidelity precursor processing of mammalian miRNAs, which constitutes a structural “mold” for adaptive miRNA evolution.

Abstract The RE1-Silencing Transcription factor (REST) is essential for neuronal differentiation. Here, we report the first 18.5-angstrom electron microscopy structure of human REST. The refined electron map suggests that REST forms a torus that can accommodate DNA double-helix in the central hole. Additionally, we quantitatively described REST binding to the canonical DNA sequence of the neuron-restrictive silencer element. We developed protocols for the expression and purification of full-length REST and the shortened variant REST-N62 produced by alternative splicing. We tested the mutual interaction of full-length REST and the splicing variant REST-N62. Revealed structure-function relationships of master neuronal repressor REST will allow finding new biological ways of prevention and treatment of neurodegenerative disorders and diseases.

SUMMARY RNA synthesis is central to life, and RNA polymerase depends on accessory factors for recovery from stalled states and adaption to environmental changes. Here we investigated the mechanism by which a helicase-like factor HelD recycles RNA polymerase. We report a cryo-EM structure of an unprecedented complex between the Mycobacterium smegmatis RNA polymerase and HelD. The crescent-shaped HelD simultaneously penetrates deep into two RNA polymerase channels that are responsible for DNA binding and substrate delivery to the active site, thereby locking RNA polymerase in an inactive state. We show that HelD prevents non-specific interactions between RNA polymerase and DNA and dissociates transcription elongation complexes, but does not inhibit RNA polymerase binding to the initiation σ factor. The liberated RNA polymerase can either stay dormant, sequestered by HelD, or upon HelD release, restart transcription. Our results provide insights into the architecture and regulation of the highly medically-relevant mycobacterial transcription machinery and define HelD as a clearing factor that removes undesirable nucleic acids from RNA polymerase.

Abstract Lipid transfer from lipoprotein particles to cells is essential for lipid homeostasis. High density lipoprotein (HDL) particles are mainly captured by cell-membrane-associated scavenger receptor class B type 1 (SR-B1) from the blood stream while low and very low density lipoprotein (LDL, VLDL) particles are mostly taken up by receptor-mediated endocytosis. However, the role of the target lipid membrane itself in the transfer process has been largely neglected so far. Here, we study how lipoprotein particles (HDL, LDL and VLDL) interact with synthetic lipid bilayers and cell-derived membranes and transfer their cargo subsequently. Employing cryo-electron microscopy, spectral imaging and fluorescence (cross) correlation spectroscopy allowed us to observe integration of all major types of lipoprotein particles into the membrane and delivery of their cargo in a receptor-independent manner. Importantly, biophysical properties of the target cell membranes change upon cargo delivery. The concept of receptor-independent interaction of lipoprotein particles with membranes helps to better understand lipoprotein particle biology and can be exploited for novel treatments of dyslipidemia diseases.

Abstract The bacterial spore owes its incredible resistance capacities to various molecular structures that protect the cell content from external aggressions. Among the determinants of resistance are the quaternary structure of the chromosome and an extracellular shell made of proteinaceous layers (the coat), the assembly of which remains poorly understood. Here, in situ cryo-electron tomography (cryo-ET) on bacteria lamellae generated by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) provides insights into the ultrastructural organization of Bacillus subtilis sporangia, including that of the DNA and nascent coat layers. Analysis of the reconstructed tomograms reveal that rather early during sporulation, the chromosome in the developing spore (the forespore) adopts a toroidal structure harboring 5.5-nm thick fibers. At the same stage, coat proteins at the surface of the forespore form a complex stack of amorphous or structured layers with distinct electron density, dimensions and organization. We investigated the nature of the nascent coat layers in various mutant strains using cryo-FIBM/ET and transmission electron microscopy on resin sections of freeze-substituted bacteria. Combining these two cellular electron microscopy approaches, we distinguish seven nascent coat regions with different molecular properties, and propose a model for the contribution of the morphogenetic proteins SpoIVA, SpoVID, SafA and/or CotE. Significance statement Bacterial spores are dormant cells that can resist to multiple stresses, including antibiotics, detergents, irradiation and high temperatures. Such resilience is an asset when spores are used for the benefit of humans, as in the case of probiotics, or a major problem for public health, food safety or biowarfare when it comes to spores of pathogenic bacteria. In this study, we combined state-of-the-art cryo-electron tomography and conventional cellular electron microscopy to provide insights into intermediate stages of spore development. Our data reveal the intracellular reorganization of the chromosome into a toroidal fibrillar structure and the complex assembly of the multi-protein, multilayered extracellular coat, shedding light on the mechanisms by which the spore acquires its incredible resistance capacities.

Abstract The globally distributed marine alga Emiliania huxleyi produces reflective calcite disks (coccoliths) that increase the albedo of ocean water and thus reduce the heat absorption in the ocean, which cools the Earth’s climate. The population density of E. huxleyi is restricted by nucleocytoplasmic large DNA viruses, including E. huxleyi virus 201 (EhV-201). Despite the impact of E. huxleyi viruses on the climate, there is limited information about their structure and replication. Here we show that the dsDNA genome inside the EhV-201 virion is protected by an inner membrane, capsid, and outer membrane decorated with numerous transmembrane proteins. The virions are prone to deformation, and parts of their capsids deviate from the icosahedral arrangement. EhV-201 virions infect E. huxleyi by using their fivefold vertex to bind to a host cell and fuse the virus’s inner membrane with the plasma membrane. Whereas the replication of EhV-201 probably occurs in the nucleus, virions assemble in the cytoplasm at the surface of endoplasmic reticulum-derived membrane segments. Genome packaging initiates synchronously with the capsid assembly and completes through an aperture in the forming capsid. Upon the completion of genome packaging, the capsids change conformation, which enables them to acquire an outer membrane by budding into intracellular vesicles. EhV-201 infection induces a loss of surface protective layers from E. huxleyi cells, which allows the continuous release of virions by exocytosis. Our results provide insight into how EhVs bypass the surface protective layers of E. huxleyi and exploit the organelles of an infected cell for progeny assembly.