The application of single-cell genome sequencing to large cell populations has been hindered by technical challenges in isolating single cells during genome preparation. Here we present single-cell genomic sequencing (SiC-seq), which uses droplet microfluidics to isolate, fragment, and barcode the genomes of single cells, followed by Illumina sequencing of pooled DNA. We demonstrate ultra-high-throughput sequencing of >50,000 cells per run in a synthetic community of Gram-negative and Gram-positive bacteria and fungi. The sequenced genomes can be sorted in silico based on characteristic sequences. We use this approach to analyze the distributions of antibiotic-resistance genes, virulence factors, and phage sequences in microbial communities from an environmental sample. The ability to routinely sequence large populations of single cells will enable the de-convolution of genetic heterogeneity in diverse cell populations.

Myeloid malignancies, including acute myeloid leukaemia (AML), arise from the expansion of haematopoietic stem and progenitor cells that acquire somatic mutations. Bulk molecular profiling has suggested that mutations are acquired in a stepwise fashion: mutant genes with high variant allele frequencies appear early in leukaemogenesis, and mutations with lower variant allele frequencies are thought to be acquired later1–3. Although bulk sequencing can provide information about leukaemia biology and prognosis, it cannot distinguish which mutations occur in the same clone(s), accurately measure clonal complexity, or definitively elucidate the order of mutations. To delineate the clonal framework of myeloid malignancies, we performed single-cell mutational profiling on 146 samples from 123 patients. Here we show that AML is dominated by a small number of clones, which frequently harbour co-occurring mutations in epigenetic regulators. Conversely, mutations in signalling genes often occur more than once in distinct subclones, consistent with increasing clonal diversity. We mapped clonal trajectories for each sample and uncovered combinations of mutations that synergized to promote clonal expansion and dominance. Finally, we combined protein expression with mutational analysis to map somatic genotype and clonal architecture with immunophenotype. Our findings provide insights into the pathogenesis of myeloid transformation and how clonal complexity evolves with disease progression. The evolution of myeloid malignancies is investigated using combined single-cell sequencing and immunophenotypic analysis.

Abstract Studies of acute myeloid leukemia rely on DNA sequencing and immunophenotyping by flow cytometry as primary tools for disease characterization. However, leukemia tumor heterogeneity complicates integration of DNA variants and immunophenotypes from separate measurements. Here we introduce DAb-seq, a novel technology for simultaneous capture of DNA genotype and cell surface phenotype from single cells at high throughput, enabling direct profiling of proteogenomic states in tens of thousands of cells. To demonstrate the approach, we analyze the disease of three patients with leukemia over multiple treatment timepoints and disease recurrences. We observe complex genotype-phenotype dynamics that illustrate the subtlety of the disease process and the degree of incongruity between blast cell genotype and phenotype in different clinical scenarios. Our results highlight the importance of combined single-cell DNA and protein measurements to fully characterize the heterogeneity of leukemia.

Abstract Single cell sequencing is useful for resolving complex systems into their composite cell types and computationally mining them for unique features that are masked in pooled sequencing. However, while commercial instruments have made single cell analysis widespread for mammalian cells, analogous tools for microbes are limited. Here, we present EASi-seq ( E asily A ccessible S ingle microbe seq uencing). By adapting the single cell workflow of the commercial Mission Bio Tapestri instrument, this method allows for efficient sequencing of individual microbes’ genomes. EASi-seq allows thousands of microbes to be sequenced per run and, as we show, can generate detailed atlases of human and environmental microbiomes. The ability to capture large shotgun genome datasets from thousands of single microbes provides new opportunities in discovering and analyzing species subpopulations. To facilitate this, we develop a companion bioinformatic pipeline that clusters microbes by similarity, improving whole genome assembly, strain identification, taxonomic classification, and gene annotation. In addition, we demonstrate integration of metagenomic contigs with the EASi-seq datasets to reduce capture bias and increase coverage. Overall, EASi-seq enables high quality single cell genomic data for microbiome samples using an accessible workflow that can be run on a commercially available platform.

Background: CRISPR-based genetic medicines offer a promising “one and done” approach to improve cardiovascular health by lowering LDL-C. We performed a comparative analysis of different gene editing approaches to targeting PCSK9 for potent and safe lowering of LDL-C. Based on our findings, we engineered two investigational products using a novel CRISPR-CasX platform: a gene editor and an epigenetic editor. We demonstrated the efficacy and safety of these agents in vivo, including in non-human primates (NHPs). Methods: We engineered two novel CasX-based molecules. STX-1100 is a CasX-based gene editor designed to knock out PCSK9 in hepatocytes and consists of an engineered CasX mRNA and a PCSK9-targeting gRNA encapsulated into lipid nanoparticles (LNPs). STX-1150 is a CasX-based epigenetic editor engineered to silence PCSK9 expression in hepatocytes. It consists of an mRNA encoding a catalytically-inactive modified CasX with a DNA methyltransferase domain and a chromatin effector domain, plus a PCSK9-targeting gRNA encapsulated into LNPs. The efficacy and selectivity of STX-1100, STX-1150, and a Cas9-based adenine base editor were assessed in vitro. Both editing and epigenetic editing approaches were advanced for testing in vivo. Results: STX-1100 achieved 95% editing of the PCSK9 gene in vitro, reducing secreted PCSK9 levels by 95%. Off-target editing was not observed in vitro at 10x EC90. In NHPs, a single dose of STX-1100 resulted in dose-dependent PCSK9 editing, saturating at 1.5 mg/kg, and leading to an LDL-C reduction of up to 54% for ≥300 days. Doses up to 3.0 mg/kg were well-tolerated. STX-1150 achieved >95% reduction in PCSK9 mRNA and protein in vitro. RNA-seq in PHHs confirmed high specificity, silencing only the PCSK9 transcript. A single dose reduced serum PCSK9 levels by >90% in vivo, with repression lasting >24 weeks. On-target CpG methylation near the PCSK9 promoter was observed, corroborating serum PCSK9 reduction. Conclusion: Through CasX engineering, we developed two agents that lower PCSK9 levels in vivo with high selectivity and durability after a single dose in mice and NHPs. Comparing different modalities suggests that gene editing and epigenetic editing may offer a greater therapeutic index and fewer off-target effects compared to existing Cas9-based approaches such as base editing. These innovative molecules show great potential for safe and durable LDL-C lowering in high-risk ASCVD patients and support advancement to clinical testing.