SUMMARY Cells repair DNA double-strand breaks (DSBs) through a complex set of pathways that are critical for maintaining genomic integrity. Here we present Repair-seq, a high-throughput screening approach that measures the effects of thousands of genetic perturbations on the distribution of mutations introduced at targeted DNA lesions. Using Repair-seq, we profiled DSB repair outcomes induced by two programmable nucleases (Cas9 and Cas12a) after knockdown of 476 genes involved in DSB repair or associated processes in the presence or absence of oligonucleotides for homology-directed repair (HDR). The resulting data enabled principled, data-driven inference of DSB end joining and HDR pathways and demonstrated that repair outcomes with superficially similar sequence architectures can have markedly different genetic dependencies. Systematic interrogation of these dependencies then uncovered unexpected relationships among DSB repair genes and isolated incompletely characterized repair mechanisms. This work provides a foundation for understanding the complex pathways of DSB repair and for optimizing genome editing across modalities.

Abstract Large-scale genetic mutant libraries are powerful approaches to interrogating genotype-phenotype correlations and identifying genes responsible for certain environmental stimuli, both of which are the central goal of life science study. We produced the first large-scale CRISPR/Cas9-induced library in a non-model multicellular organism, Bombyx mori . We developed a piggy Bac-delivered binary genome editing strategy, which can simultaneously meet the requirements of mixed microinjection, efficient multi-purpose genetic operation, and preservation of growth-defect lines. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) plasmid library containing 92,917 sgRNAs targeting promoters and exons of 14,645 protein-coding genes, established 1726 transgenic sgRNA lines following microinjection of 66,650 embryos, and generated 300 mutant lines with diverse phenotypic changes. Phenomic characterization of mutant lines identified a large set of genes responsible for visual phenotypic or economically valuable trait changes. Next, we performed pooled context-specific positive screens for tolerance to environmental pollute cadmium exposure, and identified KWMTBOMO12902 as a strong candidate gene for breeding applications in sericulture industry. Collectively, our results provide a novel and versatile approach for functional B. mori genomics, and a powerful resource for identifying key candidate genes potential for improving various economic traits. This study also demonstrates the effectiveness, practicality, and convenience of large-scale mutant libraries in other non-model organisms.

Genetic interactions have long informed our understanding of the coordinated proteins and pathways that respond to DNA damage in mammalian cells, but systematic interrogation of the genetic network underlying that system has yet to be achieved. Towards this goal, we measured 147,153 pairwise interactions among genes implicated in PARP inhibitor (PARPi) response. Evaluating genetic interactions at this scale, with and without exposure to PARPi, revealed hierarchical organization of the pathways and complexes that maintain genome stability during normal growth and defined changes that occur upon accumulation of DNA lesions due to cytotoxic doses of PARPi. We uncovered unexpected relationships among DNA repair genes, including context-specific buffering interactions between the minimally characterized AUNIP and BRCA1-A complex genes. Our work thus establishes a foundation for mapping differential genetic interactions in mammalian cells and provides a comprehensive resource for future studies of DNA repair and PARP inhibitors.

Background: Interspecies epigenome comparisons yielded functional information that cannot be revealed by genome comparison alone, begging for theoretical advances that enable principled analysis approaches. Whereas probabilistic genome evolution models provided theoretical foundation to comparative genomics studies, it remains challenging to extend DNA evolution models to epigenomes. Results: We present an effort to develop ab initio evolution models for epigenomes, by explicitly expressing the joint probability of multispecies DNA sequences and histone modifications on homologous genomic regions. This joint probability is modeled as a mixture of four components representing four evolutionary hypotheses, namely dependence and independence of interspecies epigenomic variations to sequence mutations and to sequence insertions and deletions (indels). For model fitting, we implemented a maximum likelihood method by coupling downhill simplex algorithm with dynamic programming. Based on likelihood comparisons, the model can be used to infer whether interspecies epigenomic variations depend on mutation or indels in local genomic sequences. We applied this model to analyze DNase hypersensitive regions and spermatid H3K4me3 ChIP-seq data from human and rhesus macaque. Approximately 5.5% of homologous regions in the genomes exhibited H3K4me3 modification in either species, among which approximately 67% homologous regions exhibited sequence-dependent interspecies H3K4me3 variations. Mutations accounted for less sequence-dependent H3K4me3 variations than indels. Among transposon-mediated indels, ERV1 insertions and L1 insertions were most strongly associated with H3K4me3 gains and losses, respectively. Conclusion: This work initiates a class of probabilistic evolution models that jointly model the genomes and the epigenomes, thus helps to bring evolutionary principles to comparative epigenomic studies.

Comparative epigenomics, by subjecting both epigenome and genome to interspecies comparison, has become a powerful approach to reveal regulatory features of the genome. Thus elucidated regulatory features surpassed the information derived from comparison of genomic sequences alone. Here, we present EpiAlignment, a web-based tool to align genomic regions with both DNA sequence and epigenomic data. EpiAlignment takes DNA sequence and epigenomic profiles derived by ChIP-seq, DNase-seq, or ATAC-seq from two species as input data, and outputs the best semi-global alignments. These alignments are based on EpiAlignment scores, computed by a dynamic programming algorithm that accounts for both sequence alignment and epigenome similarity. For timely response, the EpiAlignment web server automatically initiates up to 140 computing threads depending on the size of user input data. For users' convenience, we have pre-compiled the comparable human and mouse epigenome datasets in matched cell types and tissues from the Roadmap Epigenomics and ENCODE consortia. Users can either upload their own data or select pre-compiled datasets as inputs for EpiAlignment analyses. Results are presented in graphical and tabular formats where the entries can be interactively expanded to visualize additional features of these aligned regions. EpiAlignment is available at https://epialign.ucsd.edu/.

Abstract Changes in regulatory networks generate materials for evolution to create phenotypic diversity. For transcription networks, multiple studies have shown that alterations in binding sites of cis-regulatory elements correlate well with the gain or loss of specific features of the body plan. Less is known about alterations in the amino acid sequences of the transcription factors (TFs) that bind these elements. Here we study the evolution of Bicoid (Bcd), a homeodomain (HD) protein that is critical for anterior embryo patterning in Drosophila . The ancestor of Bcd (AncBcd) emerged after a duplication of a Zerknullt (Zen)-like ancestral protein (AncZB) in a suborder of flies. AncBcd diverged from AncZB, gaining novel transcriptional and translational activities. We focus on the evolution of the HD of AncBcd, which binds DNA and RNA, and is comprised of four subdomains: an N-terminal arm (NT) and three helices; H1, H2, and Recognition Helix (RH). Using chimeras of subdomains and gene rescue assays in Drosophila , we show that robust patterning activity of the Bcd HD (high frequency rescue to adulthood) is achieved only when amino acid substitutions in three separate subdomains (NT, H1, and RH) are combined. Other combinations of subdomains also yield full rescue, but with lower penetrance, suggesting alternative suboptimal activities. Our results suggest a multi-step pathway for the evolution of the Bcd HD that involved intermediate HD sequences with suboptimal activities, which constrained and enabled further evolutionary changes. They also demonstrate critical epistatic forces that contribute to the robust function of a DNA-binding domain.

The K50 homeodomain (K50HD) protein Orthodenticle (Otd) is critical for anterior embryo patterning in most metazoans. Another K50HD protein, Bicoid (Bcd), has evolved to replace Otd's ancestral function in Drosophila. Otd and Bcd bind similar DNA sequences in vitro, but how their transcriptional activities are integrated in embryo patterning is unknown. Here we define three classes of enhancers that respond differentially to binding and transcriptional activation by Bcd and Otd. Class 1 enhancers are bound by both proteins, activated by Bcd, and maintained by Otd via a feed-forward relay (FFR). Enhancers in class 2 and class 3 are bound uniquely by Bcd or Otd, respectively. Different enhancer responses are controlled by suboptimal DNA motifs preferred by Bcd or Otd, and the presence or absence of cofactor binding sites. Our results define specific patterning roles for Bcd and Otd, and provide a timing mechanism for coordinating gene expression patterns during embryonic development.