The ability to image at high speeds is necessary for biological imaging to capture fast-moving or transient events or to efficiently image large samples. However, due to the lack of rigidity of biological specimens, carrying out fast, high-resolution volumetric imaging without moving and agitating the sample has been a challenging problem. Pupil-matched remote focusing has been promising for high NA imaging systems with their low aberrations and wavelength independence, making it suitable for multicolor imaging. However, owing to the incoherent and unpolarized nature of the fluorescence signal, manipulating this emission light through remote focusing is challenging. Therefore, remote focusing has been primarily limited to the illumination arm, using polarized laser light to facilitate coupling in and out of the remote focusing optics. Here, we introduce a novel optical design that can de-scan the axial focus movement in the detection arm of a microscope. Our method splits the fluorescence signal into S and P-polarized light, lets them pass through the remote focusing module separately, and combines them with the camera. This allows us to use only one focusing element to perform aberration-free, multi-color, volumetric imaging without (a) compromising the fluorescent signal and (b) needing to perform sample/detection-objective translation. We demonstrate the capabilities of this scheme by acquiring fast dual-color 4D (3D space + time) image stacks with an axial range of 70 μm and camera-limited acquisition speed. Owing to its general nature, we believe this technique will find its application in many other microscopy techniques that currently use an adjustable Z-stage to carry out volumetric imaging, such as confocal, 2-photon, and light sheet variants.

Rapid, high-resolution volumetric imaging without moving heavy objectives or disturbing delicate samples remains challenging. Pupil-matched remote focusing offers a promising solution for high NA systems, but the fluorescence signal's incoherent and unpolarized nature complicates its application. Thus, remote focusing is mainly used in the illumination arm with polarized laser light to improve optical coupling. Here, we introduce a novel optical design that can de-scan the axial focus movement in the detection arm of a microscope. Our method splits the fluorescence signal into S and P-polarized light, lets them pass through the remote focusing module separately, and combines them with the camera. This allows us to use only one focusing element to perform aberration-free, multi-color, volumetric imaging without (a) compromising the fluorescent signal and (b) needing to perform sample/detection-objective translation. We demonstrate the capabilities of this scheme by acquiring fast dual-color 4D (3D space + time) image stacks with an axial range of 70 μm and camera-limited acquisition speed. Owing to its general nature, we believe this technique will find its application in many other microscopy techniques that currently use an adjustable Z-stage to carry out volumetric imaging, such as confocal, 2-photon, and light sheet variants.

Abstract Immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-containing Fc receptors are critical components of the innate and adaptive immune systems. FcεRI mediates the allergic response via crosslinking of IgE-bound receptors by multivalent antigens. Yet, the underlying molecular mechanisms that govern the response of FcεRI to specific antigens remain poorly understood. We compared responses induced by two antigens with distinct geometries, high valency DNP-BSA and trivalent DF3, and found unique secretion and receptor phosphorylation profiles that are due to differential recruitment of Lyn and SHIP1. To understand how these two antigens can cause such markedly different outcomes, we used direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) super-resolution imaging combined with Bayesian Grouping of Localizations (BaGoL) analysis to compare the nanoscale characteristics of FcεRI aggregates. DF3 aggregates were found to be smaller and more densely packed than DNP-BSA aggregates. Using lifetime-based Förster resonance energy transfer (FRET) measurements, we discovered that FcεRI subunits undergo structural rearrangements upon crosslinking with either antigen, and in response to interaction with monovalent antigen presented on a supported lipid bilayer. The extent of conformational change is positively correlated with signaling efficiency. Finally, we provide evidence for forces in optimizing FcεRI signaling, such that immobilizing DF3 on a rigid surface promoted degranulation while increasing DNP-BSA flexibility lowered degranulation. These results provide a link between the physical attributes of allergens, including size, shape, valency, and flexibility, and FcεRI signaling strength. Thus, the antigen modulates mast cell outcomes by creating unique aggregate geometries that tune FcεRI conformation, phosphorylation and signaling partner recruitment. Statement of Significance This work elucidates the molecular mechanisms underlying differential FcεRI signaling responses induced by antigens of distinct geometries. By combining super-resolution imaging and biophysical techniques, we demonstrate that the physical attributes of allergens, including shape, flexibility, and valency, modulate mast cell signaling outcomes by altering FcεRI aggregate organization and conformational states. This provides novel insights into the structure-function relationships governing FcεRI signal transduction and its role in mast cell activation. Overall, this work establishes a link between allergen physical properties and immune receptor signaling at the molecular level, with important implications for understanding and regulating allergic responses.