Abstract Targeting proximity labeling enzymes to specific cellular locations is a viable strategy for profiling subcellular proteomes. Here, we generated transgenic mice expressing a mitochondrial matrix-targeted ascorbate peroxidase (MAX-Tg) to analyze tissue-specific matrix proteomes. Desthiobiotin-phenol labeling of muscle tissues from MAX-Tg mice allowed for efficient profiling of mitochondrial-localized proteins in these tissues. Comparative analysis of matrix proteomes from MAX-Tg muscle tissues revealed differential enrichment of mitochondrial proteins related to energy production in between different muscle groups. Reticulon 4 interacting protein 1 (RTN4IP1), also known as Optic Atrophy-10 (OPA10), was highly enriched in the cardiac and soleus muscles and was found to localize to the mitochondrial matrix via a strong mitochondrial targeting sequence at its N-terminus. Protein structure analysis revealed that RTN4IP1 is an NADPH oxidoreductase with structural homology to bacterial quinone oxidoreductase. Enzymatic activity assays, interactome analysis, and metabolite profiling confirmed a function for RTN4IP1 in coenzyme Q (CoQ) biosynthesis. Rtn4ip1 -knockout C2C12 cells had reduced CoQ9 levels, were vulnerable to oxidative stress, and had decreased oxygen consumption rates and ATP production. Collectively, RTN4IP1 is a mitochondrial antioxidant NADPH oxidoreductase supporting oxidative phosphorylation activity in muscle tissue.

Mitochondria-ER membrane contact sites (MERCS) represent a fundamental ultrastructural feature underlying unique biochemistry and physiology in eukaryotic cells. The ER protein PDZD8 is required for the formation of MERCS in many cell types, however, its tethering partner on the outer mitochondrial membrane (OMM) is currently unknown. Here we identified the OMM protein FKBP8 as the tethering partner of PDZD8 using a combination of unbiased proximity proteomics, CRISPR-Cas9 endogenous protein tagging, Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM) tomography, and correlative light-EM (CLEM). Single molecule tracking revealed highly dynamic diffusion properties of PDZD8 along the ER membrane with significant pauses and capture at MERCS. Overexpression of FKBP8 was sufficient to narrow the ER-OMM distance, whereas independent versus combined deletions of these two proteins demonstrated their interdependence for MERCS formation. Furthermore, PDZD8 enhances mitochondrial complexity in a FKBP8-dependent manner. Our results identify a novel ER-mitochondria tethering complex that regulates mitochondrial morphology in mammalian cells.

Summary Dysregulated iron or Ca 2+ homeostasis has been reported in Parkinson’s disease (PD) models. Here we discover a connection between these two metals at the mitochondria. Elevation of iron levels causes inward mitochondrial Ca 2+ overflow, through an interaction of Fe 2+ with Mitochondrial Calcium Uniporter. In PD neurons, iron accumulation-triggered Ca 2+ influx across the mitochondrial surface leads to spatially confined Ca 2+ elevation at the outer mitochondrial membrane, which is subsequently sensed by Miro1, a Ca 2+ -binding protein. A Miro1 blood test distinguishes PD patients from controls and responds to drug treatment. Miro1-based drug screens in PD cells discover FDA-approved T-type Ca 2+ -channel blockers. Human genetic analysis reveals enrichment of rare variants in T-type Ca 2+ -channel subtypes associated with PD status. Our results identify a molecular mechanism in PD pathophysiology, and drug targets and candidates coupled with a convenient stratification method.

Proximity labeling (PL) catalyzed by promiscuous enzymes such as TurboID have enabled the proteomic analysis of subcellular regions difficult or impossible to access by conventional fractionation-based approaches. Yet some cellular regions, such as organelle contact sites, remain out of reach for current PL methods. To address this limitation, we split the enzyme TurboID into two inactive fragments that recombine when driven together by a protein-protein interaction or membrane-membrane apposition. At endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites, reconstituted TurboID catalyzed spatially-restricted biotinylation, enabling the enrichment and identification of >100 endogenous proteins, including many not previously linked to ER-mitochondria contacts. We validated eight novel candidates by biochemical fractionation and overexpression imaging. Overall, split-TurboID is a versatile tool for conditional and spatially-specific proximity labeling in cells.

Abstract Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) plays a central role in microglial biology and the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Besides DNAX-activating protein 12 (DAP12), a communal adaptor for TREM2 and many other receptors, other cellular interactors of TREM2 remain largely elusive. We employed a ‘proximity labeling’ approach using a biotin ligase, TurboID, for mapping protein–protein interactions in live mammalian cells. We discovered novel TREM2-proximal proteins with diverse functions, including those localized to the Mitochondria-ER contact sites (MERCs), a dynamic subcellular ‘hub’ implicated in a number of crucial cell physiology such as lipid metabolism. TREM2 deficiency alters the thickness (inter-organelle distance) of MERCs, a structural parameter of metabolic state, in microglia derived from human induced pluripotent stem cells. Our TurboID-based TREM2 interactome study suggest novel roles for TREM2 in the structural plasticity of the MERCs, raising the possibility that dysregulation of MERC-related TREM2 functions contribute to AD pathobiology.

Mitochondrial thermogenesis is a process in which heat is generated by mitochondrial respiration. In living organisms, the thermogenic mechanisms that maintain body temperature have been studied extensively in fat cells with little knowledge on how mitochondrial heat may act beyond energy expenditure. Here, we highlight that the exothermic oxygen reduction reaction (ΔHf° = −286 kJ/mol) is the main source of the protonophore-induced mitochondrial thermogenesis, and this heat is conducted to other cellular organelles, including the nucleus. As a result, mitochondrial heat that reached the nucleus initiated the classical heat shock response, including the formation of nuclear stress granules and the localization of heat shock factor 1 (HSF1) to chromatin. Consequently, activated HSF1 increases the level of gene expression associated with the response to thermal stress in mammalian cells. Our results illustrate heat generated within the cells as a potential source of mitochondria-nucleus communication and expand our understanding of the biological functions of mitochondria in cell physiology.

Abstract Mitochondrial thermogenesis is a process in which heat is generated by mitochondrial respiration. In living organisms, the thermogenic mechanisms that maintain body temperature have been studied extensively in fat cells, with little knowledge on how mitochondrial heat may act beyond energy expenditure. Here, we highlighted exothermic oxygen reduction reaction (ΔHf° = -285 kJ/mol) is the main source of the protonophore-induced mitochondrial thermogenesis and this heat was conducted to other cellular organelles, including the nuclei. As a result, mitochondrial heat that reached the nucleus initiated the classical heat shock response, including the formation of nuclear stress granules and localization of heat shock factor 1 to chromatin. Consequently, activated HSF1 increases gene expression associated with the response to thermal stress in mammalian cells. Our results illustrate heat generated within the cells as a potential source of mitochondrial-nucleus communication and expand our understanding of the biological functions of mitochondria in cell physiology.