Abstract Triple-negative breast cancer (TNBC) patients have a poor prognosis and few treatment options. Mouse models of TNBC are important for development of new targeted therapies, but few TNBC mouse models exist. Here, we developed a novel TNBC murine model by mimicking two common TNBC mutations with high co-occurrence: amplification of the oncogene MYC and deletion of the tumor suppressor PTEN. This Myc;Ptenfl murine model develops TN mammary tumors that display histological and molecular features commonly found in human TNBC. We performed deep omic analyses on Myc;Ptenfl tumors including machine learning for morphologic features, bulk and single-cell RNA-sequencing, multiplex immunohistochemistry and single-cell phenotyping. Through comparison with human TNBC, we demonstrated that this new genetic mouse model develops mammary tumors with differential survival that closely resemble the inter- and intra-tumoral and microenvironmental heterogeneity of human TNBC; providing a unique pre-clinical tool for assessing the spectrum of patient TNBC biology and drug response. Statement of significance The development of cancer models that mimic triple-negative breast cancer (TNBC) microenvironment complexities is critical to develop effective drugs and enhance disease understanding. This study addresses a critical need in the field by identifying a murine model that faithfully mimics human TNBC heterogeneity and establishing a foundation for translating preclinical findings into effective human clinical trials.

Abstract Cell size is believed to influence cell growth and metabolism. Consistently, several studies have revealed that large cells have lower mass accumulation rates per unit mass (i.e. growth efficiency) than intermediate sized cells in the same population. Size-dependent growth is commonly attributed to transport limitations, such as increased diffusion timescales and decreased surface-to-volume ratio. However, separating cell size and cell cycle dependent growth is challenging. To decouple and quantify cell size and cell cycle dependent growth effects we monitor growth efficiency of freely proliferating and cycling polyploid mouse lymphocytes with high resolution. To achieve this, we develop large-channel suspended microchannel resonators that allow us to monitor mass of single cells ranging from 40 pg (small diploid lymphocyte) to over 4000 pg, with a resolution ranging from ~1% to ~0.05%. We find that mass increases exponentially with respect to time in early cell cycle but transitions to linear dependence during late S and G2 stages. This growth behavior repeats with every endomitotic cycle as cells grow in to polyploidy. Overall, growth efficiency changes 29% due to cell cycle. In contrast, growth efficiency did not change due to cell size over a 100-fold increase in cell mass during polyploidization. Consistently, growth efficiency remained constant when cell cycle was arrested in G2. Thus, cell cycle is a primary determinant of growth efficiency and increasing cell size does not impose transport limitations that decrease growth efficiency in cultured mammalian cells. Significance statement Cell size is believed to influence cell behavior through limited transport efficiency in larger cells, which could decrease the growth rate of large cells. However, this has not been experimentally investigated due to a lack of non-invasive, high-precision growth quantification methods suitable for measuring large cells. Here, we have engineered large versions of microfluidic mass sensors called suspended microchannel resonators in order to study the growth of single mammalian cells that range 100-fold in mass. This revealed that the absolute size of a cell does not impose strict transport or other limitations that would inhibit growth. In contrast to cell size, however, cell cycle has a relatively large influence on growth and our measurements allow us to decouple and quantify the growth effects caused by cell cycle and cell size.

Abstract Senescent cell-derived extracellular vesicles (senEVs) serve as crucial signaling mediators in senescence. To elucidate the role of senEVs in inflammatory responses to senescence, we established and validated an engraftment-based senescence model in wild-type mice, enabling genetic blockade of senEV release in vivo . Our findings reveal that senEVs play a pivotal role in orchestrating the rapid clearance of senescent cells and suppressing tumor recurrence. In the absence of senEVs, recruitment of MHC-II+ antigen presenting cells into the senescence microenvironment was significantly impaired. Additionally, inhibition of senEV release redirected the primary target of senescent cell signaling from antigen presenting cells to neutrophils. Furthermore, antigen presenting cells recruited and activated CCR2+ T H17 cells, resulting in the inhibition of B cell activation. Through multimodal transcriptional and proteomic analyses, we identified six ligands specific to senEVs, implicating their involvement in promoting cell adhesion. Collectively, our findings suggest that senEVs complement the activity of secreted inflammatory mediators by recruiting and activating distinct immune cell subsets, thus facilitating the efficient clearance of senescent cells.

ABSTRACT Paclitaxel is a standard of care neoadjuvant therapy for patients with triple negative breast cancer (TNBC); however, it shows limited benefit for locally advanced or metastatic disease. Here we used a coordinated experimental-computational approach to explore the influence of paclitaxel on the cellular and molecular responses of TNBC cells. We found that escalating doses of paclitaxel resulted in multinucleation, promotion of senescence, and initiation of DNA damage induced apoptosis. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) of TNBC cells after paclitaxel treatment revealed upregulation of innate immune programs canonically associated with interferon response and downregulation of cell cycle progression programs. Systematic exploration of transcriptional responses to paclitaxel and cancer-associated microenvironmental factors revealed common gene programs induced by paclitaxel, IFNB, and IFNG. Transcription factor (TF) enrichment analysis identified 13 TFs that were both enriched based on activity of downstream targets and also significantly upregulated after paclitaxel treatment. Functional assessment with siRNA knockdown confirmed that the TFs FOSL1, NFE2L2 and ELF3 mediate cellular proliferation and also regulate nuclear structure. We further explored the influence of these TFs on paclitaxel-induced cell cycle behavior via live cell imaging, which revealed altered progression rates through G1, S/G2 and M phases. We found that ELF3 knockdown synergized with paclitaxel treatment to lock cells in a G1 state and prevent cell cycle progression. Analysis of publicly available breast cancer patient data showed that high ELF3 expression was associated with poor prognosis and enrichment programs associated with cell cycle progression. Together these analyses disentangle the diverse aspects of paclitaxel response and identify ELF3 upregulation as a putative biomarker of paclitaxel resistance in TNBC.

SUMMARY Efforts to cure BCR::ABL1 B cell acute lymphoblastic leukemia (Ph+ ALL) solely through inhibition of ABL1 kinase activity have thus far been insufficient despite the availability of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) with broad activity against resistance mutants. The mechanisms that drive persistence within minimal residual disease (MRD) remain poorly understood and therefore untargeted. Utilizing 13 patient-derived xenograft (PDX) models and clinical trial specimens of Ph+ ALL, we examined how genetic and transcriptional features co-evolve to drive progression during prolonged TKI response. Our work reveals a landscape of cooperative mutational and transcriptional escape mechanisms that differ from those causing resistance to first generation TKIs. By analyzing MRD during remission, we show that the same resistance mutation can either increase or decrease cellular fitness depending on transcriptional state. We further demonstrate that directly targeting transcriptional state-associated vulnerabilities at MRD can overcome BCR::ABL1 independence, suggesting a new paradigm for rationally eradicating MRD prior to relapse. Finally, we illustrate how cell mass measurements of leukemia cells can be used to rapidly monitor dominant transcriptional features of Ph+ ALL to help rationally guide therapeutic selection from low-input samples. HIGHLIGHTS Relapse after remission on TKI can harbor mutations in ABL1, RAS, or neither Mutations and development-like cell state dictate fitness in residual disease Co-targeting cell state and ABL1 markedly reduces MRD Biophysical measurements provide an integrative, rapid measurement of cell state

Abstract Existing pre-clinical methods for acquiring dissemination kinetics of rare circulating tumor cells (CTCs) en route to forming metastases have not been capable of providing a direct measure of CTC intravasation rate and subsequent half-life in the circulation. Here, we demonstrate an approach for measuring endogenous CTC kinetics by continuously exchanging CTC-containing blood over several hours between un-anesthetized, tumor-bearing mice and healthy, tumor-free counterparts. By tracking CTC transfer rates using an autochthonous small cell lung cancer model, we extrapolated half-life times in the circulation of 50-100 seconds and intravasation rates between 4,000 and 27,000 CTCs/hour – an average daily shedding rate equivalent to ∼0.07% of the total number of primary tumor cells in the lung. Additionally, transfer of 1-2% of daily-shed CTCs from late-stage tumor-bearing mice generated macrometastases in healthy recipient mice. We envision that our technique will help further elucidate the role of CTCs and the rate-limiting steps in metastasis.

During development, multicellular rosettes serve as important cellular intermediates in the formation of diverse organ systems. Multicellular rosettes are transient epithelial structures that are defined by the apical constriction of cells towards the rosette center. Due to the important role these structures play during development, understanding the molecular mechanisms by which rosettes are formed and maintained is of high interest. Utilizing the zebrafish posterior lateral line primordium (pLLP) as a model system, we identify the RhoA GEF Mcf2lb as a regulator of rosette integrity. The pLLP is a group of âˆ¼150 cells that migrates along the zebrafish trunk and is organized into epithelial rosettes; these are deposited along the trunk and will differentiate into sensory organs called neuromasts (NMs). Using single-cell RNA sequencing and whole-mount in situ hybridization, we showed that mcf2lb is expressed in the pLLP during migration. Given the known role of RhoA in rosette formation, we asked whether Mcf2lb plays a role in regulating apical constriction of cells within rosettes. Live imaging and subsequent 3D analysis of mcf2lb mutant pLLP cells showed disrupted apical constriction and subsequent rosette organization. This in turn resulted in a unique posterior Lateral Line phenotype: an excess number of deposited NMs along the trunk of the zebrafish. Cell polarity markers ZO-1 and Par-3 were apically localized, indicating that pLLP cells are normally polarized. In contrast, signaling components that mediate apical constriction downstream of RhoA, Rock-2a and non-muscle Myosin II were diminished apically. Altogether our results suggest a model whereby Mcf2lb activates RhoA, which in turn activates downstream signaling machinery to induce and maintain apical constriction in cells incorporated into rosettes.

We introduce a microfluidic platform that enables single-cell mass and growth rate measurements upstream of single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) to generate paired single-cell biophysical and transcriptional data sets. Biophysical measurements are collected with a serial suspended microchannel resonator platform (sSMR) that utilizes automated fluidic state switching to load individual cells at fixed intervals, achieving a throughput of 120 cells per hour. Each single-cell is subsequently captured downstream for linked molecular analysis using an automated collection system. From linked measurements of a murine leukemia (L1210) and pro-B cell line (FL5.12), we identify gene expression signatures that correlate significantly with cell mass and growth rate. In particular, we find that both cell lines display a cell-cycle signature that correlates with cell mass, with early and late cell-cycle signatures significantly enriched amongst genes with negative and positive correlations with mass, respectively. FL5.12 cells also show a significant correlation between single-cell growth efficiency and a G1-S transition signature, providing additional transcriptional evidence for a phenomenon previously observed through biophysical measurements alone. Importantly, the throughput and speed of our platform allows for the characterization of phenotypes in dynamic cellular systems. As a proof-of-principle, we apply our system to characterize activated murine CD8+ T cells and uncover two unique features of CD8+ T cells as they become proliferative in response to activation: i) the level of coordination between cell cycle gene expression and cell mass increases, and ii) translation-related gene expression increases and shows a correlation with single-cell growth efficiency. Overall, our approach provides a new means of characterizing the transcriptional mechanisms of normal and dysfunctional cellular mass and growth rate regulation across a range of biological contexts.

ABSTRACT Peripheral sensory neurons are a critical part of the nervous system that transmit a multitude of sensory stimuli to the central nervous system. During larval and juvenile stages in zebrafish, this function is mediated by Rohon-Beard somatosensory neurons (RBs). RBs are optically accessible and amenable to experimental manipulation, making them a powerful system for mechanistic investigation of sensory neurons. Previous studies provided evidence that RBs fall into multiple subclasses; however, the number and molecular make up of these potential RB subtypes have not been well defined. Using a single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) approach, we demonstrate that larval RBs in zebrafish fall into three, largely non-overlapping classes of neurons. We also show that RBs are molecularly distinct from trigeminal neurons in zebrafish. Cross-species transcriptional analysis indicates that one RB subclass is similar to a mammalian group of A-fiber sensory neurons. Another RB subclass is predicted to sense multiple modalities, including mechanical stimulation and chemical irritants. We leveraged our scRNA-seq data to determine that the fibroblast growth factor (Fgf) pathway is active in RBs. Pharmacological and genetic inhibition of this pathway led to defects in axon maintenance and RB cell death. Moreover, this can be phenocopied by treatment with dovitinib, an FDA-approved Fgf inhibitor with a common side effect of peripheral neuropathy. Importantly, dovitinib-mediated axon loss can be suppressed by loss of Sarm1, a positive regulator of neuronal cell death and axonal injury. This offers a molecular target for future clinical intervention to fight neurotoxic effects of this drug.