Abstract O-GalNAc type glycosylation is a common post-translational modification (PTM) of proteins catalyzed by polypeptide GalNAc transferases, but the substrate specificity of these transferases is poorly understood. Here we develop a strategy based on integral thermal proteome solubility profiling to identify and prioritize the protein substrates of polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 1 (GALNT1). Combined with glycoprotein enrichment followed by HCD and soft EThcD gas-phase fragmentation technique, we uncover hundreds of novel GALNT1 substrates in two model human cell lines. GALNT1-mediated O-glycosylation is more common on Thr than Ser residues, with a strong preference for Pro at positions +3 and +4 in respect to O-glycosylation. These results implicate GALNT1 in potentially regulating proteins in several diverse pathways, including some unexpected processes, such as TCA cycle and DNA transcription. This study depicts a roadmap for identification of functional substrates for glycosyltransferases, facilitating fundamental insight into the role of glycosylation in homeostasis and disease.

We recently revealed significant variability in protein corona characterization across various proteomics facilities, indicating that data sets are not comparable between independent studies. This heterogeneity mainly arises from differences in sample preparation protocols, mass spectrometry workflows, and raw data processing. To address this issue, we developed standardized protocols and unified sample preparation workflows, distributing uniform protein corona digests to several top-performing proteomics centers from our previous study. We also examined the influence of using similar mass spectrometry instruments on data homogeneity and standardized database search parameters and data processing workflows. Our findings reveal a remarkable stepwise improvement in protein corona data uniformity, increasing overlaps in protein identification from 11% to 40% across facilities using similar instruments and through a uniform database search. We identify the key parameters behind data heterogeneity and provide recommendations for designing experiments. Our findings should significantly advance the robustness of protein corona analysis for diagnostic and therapeutics applications.

Abstract Post-translational modifications (PTMs) are under significant focus in molecular biomedicine due to their importance in signal transduction in most cellular and organismal processes. Characterization of PTMs, discrimination between functional and inert PTMs, quantification of their occupancies and PTM crosstalk are demanding tasks in each biosystem. On top of that, the study of each PTM often necessitates a particular laborious experimental design. Here, we present a PTM-centric proteome informatic pipeline for prediction of relevant PTMs in mass spectrometry-based proteomics data in the absence of a priori information. Upon prediction, such PTMs can be incorporated in a refined database search. As a practical application, we showed how this pipeline suggested performing glycoproteomics in oral squamous cell carcinoma based on proteome profile of primary tumors. Subsequently, using proteome profiling of treated cells with two PTM-modulating kinase inhibitors, we experimentally identified cellular proteins that are differentially expressed in response to multikinase inhibitors dasatinib and staurosporine. Computational enrichment analysis was employed to determine the potential PTMs of protein targets for both drugs. Finally, we conducted an additional round of database search with the predicted PTMs. Our pipeline helped to analyze the enriched PTMs and even the detected proteins that were not identified in the initial search. Our findings support the idea of PTM-centric searching of MS data in proteomics based on computational enrichment analysis and we propose that this approach be integrated into future proteomics search engines.

Abstract Multifaceted interrogation of the proteome deepens the system‐wide understanding of biological systems; however, mapping the redox changes in the proteome has so far been significantly more challenging than expression and solubility/stability analyses. Here, the first high‐throughput redox proteomics approach integrated with expression analysis (REX) is devised and combined with the Proteome Integral Solubility Alteration (PISA) assay. The whole PISA‐REX experiment with up to four biological replicates can be multiplexed into a single tandem mass tag TMTpro set. For benchmarking this compact tool, HCT116 cells treated with auranofin are analyzed, showing great improvement compared with previous studies. PISA‐REX is then applied to study proteome remodeling upon stimulation of human monocytes by interferon α (IFN‐α). Applying this tool to study the proteome changes in plasmacytoid dendritic cells (pDCs) isolated from wild‐type versus Ncf1 ‐mutant mice treated with interferon α , shows that NCF1 deficiency enhances the STAT1 pathway and modulates the expression, solubility, and redox state of interferon‐induced proteins. Providing comprehensive multifaceted information on the proteome, the compact PISA‐REX has the potential to become an industry standard in proteomics and to open new windows into the biology of health and disease.

Abstract Rapamycin is a natural antifungal, immunosuppressive, and antiproliferative compound allosterically inhibiting mTOR complex 1. The ubiquitin-proteasome system (UPS) responsible for protein turnover is usually not listed among the pathways affected by mTOR signaling; however, a number of reports indicated the interplay between UPS and mTOR. It is also reported that rapamycin and analogs can allosterically inhibit the proteasome itself. We studied the molecular effect of rapamycin and its analogs (rapalogs), everolimus, and temsirolimus by expression chemical proteomics on A549 cell line. The analysis revealed that the cellular response to everolimus differs dramatically from that of rapamycin and temsirolimus. In cluster analysis the effect of everolimus was similar to that of bortezomib, a well-established proteasome inhibitor. UPS-related pathways were enriched in the cluster of proteins specifically up-regulated upon everolimus and bortezomib treatments, suggesting that both compounds have similar proteasome inhibition effects. In particular, the total amount of ubiquitin was significantly elevated in the samples treated with everolimus and bortezomib, and the analysis of the polyubiquitination patterns revealed elevated intensities of the ubiquitin peptide with a GG modification at K48 residue, consistent with a bottleneck in the proteasomal protein degradation. Moreover, everolimus treatment resulted in both ubiquitin phosphorylation and a significant amount of semi-tryptic peptides illustrating the induction of protease activity. These observations suggest that everolimus affects the ubiquitin-proteasome system in a unique way and its mechanism of action is strikingly different from that of its close chemical analogs, rapamycin and temsirolimus. Data are available via ProteomeXchange with identifier PXD045774.

We present a publicly available, expandable proteome signature library of anticancer molecules in A549 adenocarcinoma cells. Based on 287 proteomes affected by 56 drugs, the main dataset contains 7,328 proteins and 1,307,859 refined protein-drug pairs. By employing the specificity concept in partial least square modeling, deconvolution of drug targets and mechanistic proteins is achieved for most compounds, including some kinase inhibitors. We built the first protein co-regulation database that takes into account both protein expression and degradation. A surprising number of strong anti-correlations is found, underscoring the importance of protein repression in cell regulation. Our analysis uncovered a group of proteins with extremely steady expression which are likely essential for core cellular functions. These findings bring about deeper understanding of cell mechanics. Extension of the dataset to novel compounds will facilitate drug design. The introduced specificity concept and modeling scheme are beneficial in other analysis types as well.

Abstract The immediate molecular consequences of traumatic brain injuries or TBI are poorly understood. Here, we simulated TBI using an innovative laboratory apparatus that employs a 5.1 kg dummy head holding neuronal cells and generating a ≤4,000 g-force acceleration upon impact. Dynamic impact led to both reduction in neuron viability and massive solubility changes in the proteome profiled using Proteome Integral Solubility Alteration (PISA) assay. The affected proteins mapped not only to the expected pathways like cell adhesion, collagen and laminin structures, as well as response to stress, but also to other dense protein networks, such as immune response, complement and coagulation cascades. The cellular effects are found to be mainly due to the shockwave rather than the g-force acceleration. Soft materials could reduce the impact severity only until being fully compressed. This study shows way to develop a proteome-based meter for measuring irreversible shockwave-induced cell damage and provides a resource for identifying TBI protein biomarkers and potential drug targets for developing products aiming at primary prevention and intervention.

Abstract The idea that ingesting heavy stable isotopes can increase longevity emerged shortly after the discovery of deuterium in the early 1930s and has been extensively tested since then on animals. Here we present the first experimental evidence for the opposite. Growing C. elegans on bacteria E. coli that are in turn fed on a diet depleted of heavy isotopes of C, H, N and O produced ultralight worms that grow and mature faster but have a shorter lifespan. Based on the differences in expression and solubility of proteins, we established an aging pseudo-time scale. Notably, the newly born ultralight worms appear to be significantly “younger” than their normal counterparts, while at day 10 they are significantly “older”. Pathway analysis revealed involvement of mitochondria; analysis of reactive oxygen species (ROS) confirmed significant ROS overproduction in ultralight worms that increases further with age. These findings provide a new modality of affecting the lifespan in this important animal model of human diseases and aging.

Abstract Here we present a high-throughput virtual top-down proteomics approach that restores the molecular weight (MW) information in shotgun proteomics, and demonstrate its utility in studying proteolytic events in programmed cell death. With Gel-Assisted Proteome Position Integral Shift (GAPPIS), we quantified over 7000 proteins in staurosporine-induced apoptotic HeLa cells and identified 89 proteins exhibiting in a statistically significant manner at least two of the following features: 1) a negative MW shift; 2) an elevated ratio in a pair of a semi-tryptic and tryptic peptide, 3) a negative shift in the standard deviation of MW estimated for different peptides, and 4) a negative shift in skewness of the same data. Of these proteins, 60 molecules were novel caspase 3 substrates. Further analysis identified the preferred cleavage sites consistent with the known caspase cleavages after the DXXD motif. As a powerful tool for high-throughput MW analysis simultaneously with the conventional expression analysis, GAPPIS assay can prove useful in studying a broad range of biological processes involving proteolytic events.

Abstract Knowledge of the targets of therapeutic compounds is vital for understanding their action mechanisms and side effects, but such valuable data is seldom available. The multiple complementary techniques needed for comprehensive target characterization must combine data reliability with sufficient analysis throughput. Here, we leveraged the Proteome Integral Solubility Alteration (PISA) assay to comprehensively characterize the targets of 67 approved drugs and candidate compounds against lung cancer. The analysis was performed on two cell lines representing different lung cancer phenotypes and novel targets for 77% of the tested molecules were found. Comparison of the protein solubility shifts in lysate vs. living cells highlighted the targets directly interacting with the compounds. As PISA analysis is now joining the arsenal of fast and reliable target characterization techniques, the presented database, ThermoTargetMiner, will become a useful resource in lung cancer research.