Open sesame! The autophagosome is a double-membraned intracellular structure involved in the disposal of damaged or defunct organelles. Autophagosome formation requires a number of autophagy-related (ATG) proteins. Among them, the key conjugation systems ATG8 and ATG12 are widely exploited in the detection of autophagy in many organisms. However, their precise function in autophagy remains unknown. Tsuboyama et al. identified an unexpected role of ATG3, an important enzyme in the ATG conjugation systems, in efficient degradation and opening of the inner autophagosomal membrane after fusion with lysosomes (see the Perspective by Levine). Their live-imaging system revealed the entire life of an autophagosome in mammalian cells. Science , this issue p. 1036 ; see also p. 968

Receptor dimerization is important for many signaling pathways. However, the monomer-dimer equilibrium has never been fully characterized for any receptor with a 2D equilibrium constant as well as association/dissociation rate constants (termed super-quantification). Here, we determined the dynamic equilibrium for the N-formyl peptide receptor (FPR), a chemoattractant G protein-coupled receptor (GPCR), in live cells at 37°C by developing a single fluorescent-molecule imaging method. Both before and after liganding, the dimer-monomer 2D equilibrium is unchanged, giving an equilibrium constant of 3.6 copies/µm(2), with a dissociation and 2D association rate constant of 11.0 s(-1) and 3.1 copies/µm(2)s(-1), respectively. At physiological expression levels of ∼2.1 receptor copies/µm(2) (∼6,000 copies/cell), monomers continually convert into dimers every 150 ms, dimers dissociate into monomers in 91 ms, and at any moment, 2,500 and 3,500 receptor molecules participate in transient dimers and monomers, respectively. Not only do FPR dimers fall apart rapidly, but FPR monomers also convert into dimers very quickly.

Mitochondria can be degraded by autophagy in a process termed mitophagy. The Parkinson-disease-associated ubiquitin ligase Parkin can trigger mitophagy of depolarized mitochondria. However, it remains to be determined how the autophagy machinery is involved in this specific type of autophagy. It has been speculated that adaptor proteins such as p62 might mediate the interaction between the autophagosomal LC3 family of proteins and ubiquitylated proteins on mitochondria. Here, we describe our systematic analysis of the recruitment of Atg proteins in Parkin-dependent mitophagy. Structures containing upstream Atg proteins, including ULK1, Atg14, DFCP1, WIPI-1 and Atg16L1, can associate with depolarized mitochondria even in the absence of membrane-bound LC3. Atg9A structures are also recruited to these damaged mitochondria as well as to the autophagosome formation site during starvation-induced canonical autophagy. In the initial steps of Parkin-mediated mitophagy, the structures containing the ULK1 complex and Atg9A are independently recruited to depolarized mitochondria and both are required for further recruitment of downstream Atg proteins except LC3. Autophagosomal LC3 is important for efficient incorporation of damaged mitochondria into the autophagosome at a later stage. These findings suggest a process whereby the isolation membrane is generated de novo on damaged mitochondria as opposed to one where a preformed isolation membrane recognizes mitochondria.

Autophagosome formation is governed by sequential functions of autophagy-related (ATG) proteins. Although their genetic hierarchy in terms of localization to the autophagosome formation site has been determined, their temporal relationships remain largely unknown. In this study, we comprehensively analyzed the recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site by live-cell imaging, and determined their temporal relationships. Although ULK1 and ATG5 are separated in the genetic hierarchy, they synchronously accumulate at pre-existing VMP1-positive punctate structures, followed by recruitment of ATG14, ZFYVE1, and WIPI1. Only a small number of ATG9 vesicles appear to be associated with these structures. Finally, LC3 and SQSTM1/p62 accumulate synchronously, while the other ATG proteins dissociate from the autophagic structures. These results suggest that autophagosome formation takes place on the VMP1-containing domain of the endoplasmic reticulum or a closely related structure, where ULK1 and ATG5 complexes are synchronously recruited.

Autophagy is mediated by a unique organelle, the autophagosome. Autophagosome formation involves a number of autophagy-related (ATG) proteins and complicated membrane dynamics. Although the hierarchical relationships of ATG proteins have been investigated, how individual ATG proteins or their complexes contribute to the organization of the autophagic membrane remains largely unknown. Here, systematic ultrastructural analysis of mouse embryonic fibroblasts and HeLa cells deficient in various ATG proteins revealed that the emergence of the isolation membrane (phagophore) requires FIP200/RB1CC1, ATG9A, and PtdIns 3-kinase activity. By contrast, small premature isolation membrane- and autophagosome-like structures were generated in cells lacking VMP1 and ATG2A/B, respectively. The isolation membranes could elongate in cells lacking ATG5, but these did not mature into autophagosomes. We also found that ferritin clusters accumulated at the autophagosome formation site together with p62/SQSTM1 in autophagy-deficient cells. These results reveal the specific functions of these representative ATG proteins in autophagic membrane organization and ATG-independent recruitment of ferritin to the autophagosome formation site.

Abstract The formation of autophagosomes involves dynamic morphological changes of a phagophore from a disk-shaped membrane cisterna into a cup-shaped intermediate and a spherical autophagosome. However, the physical mechanism behind these morphological changes remains elusive. Here, we determined the average shapes of phagophores by statistically investigating three-dimensional electron micrographs of more than 100 phagophores. The results showed that the cup-shaped structures adopted a characteristic morphology; they were longitudinally elongated, and the rim was catenoidal with an outwardly recurved shape. To understand these characteristic shapes, we established a theoretical model of the shape of entire phagophores. The model quantitatively reproduced the average morphology and revealed that the characteristic shape of phagophores (i.e., an elongated shape with a catenoidal rim) was primarily determined by the relative size of the open rim to the total surface area. These results suggest that autophagosomal membranes are highly flexible and that the morphological changes during autophagosome formation follow a stable path determined by elastic bending energy minimization. Summary The formation of autophagosomes involves dynamic morphological changes of membrane cisternae. Sakai et al. determined the average shapes of forming autophagosomes by statistically investigating three-dimensional electron micrographs and established a theoretical model that quantitatively reproduces the phagophore shapes.

Abstract Using single-molecule imaging with enhanced time resolutions down to 5 ms, we found that CD59-cluster rafts and GM1-cluster rafts stably induced in the outer leaflet of the plasma membrane (PM), which triggered the activation of Lyn, H-Ras, and ERK, continually recruited Lyn and H-Ras right beneath them in the inner leaflet, with dwell lifetimes of <0.1 s. The detection was possible due to the enhanced time resolutions employed here. The recruitment depended on the PM cholesterol and saturated alkyl chains of Lyn and H-Ras, whereas it was blocked by the non-raftophilic transmembrane protein moiety and unsaturated alkyl chains linked to the inner-leaflet molecules. Since GM1-cluster rafts recruited Lyn and H-Ras as efficiently as CD59-cluster rafts, and the protein moieties of Lyn and H-Ras were not required for the recruitment, we conclude that the transbilayer raft phases induced by the outer-leaflet stabilized rafts recruit lipid-anchored signaling molecules by lateral raft-lipid interactions, and thus serve as a key signal transduction platform. Summary High-speed single-molecule imaging indicated that CD59-cluster rafts and GM1-cluster rafts stably induced in the plasma membrane outer leaflet generated nano-scale transbilayer raft phases, which continually and transiently recruited Lyn and H-Ras in the inner leaflet by cooperative raft-lipid interactions.

During macroautophagy, cytoplasmic constituents are engulfed by autophagosomes. Lysosomes fuse with closed autophagosomes but not with unclosed intermediate structures. This is achieved in part by the late recruitment of the autophagosomal SNARE syntaxin 17 (STX17) to mature autophagosomes. However, how STX17 recognizes autophagosome maturation is not known. Here, we show that this temporally regulated recruitment of STX17 depends on the positively charged C-terminal region of STX17. Consistent with this finding, mature autophagosomes are more negatively charged compared with unclosed intermediate structures. This electrostatic maturation of autophagosomes is likely driven by the accumulation of phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) in the autophagosomal membrane. Accordingly, dephosphorylation of autophagosomal PI4P prevents the association of STX17 to autophagosomes. Furthermore, molecular dynamics simulations support PI4P-dependent membrane insertion of the transmembrane helices of STX17. Based on these findings, we propose a model in which STX17 recruitment to mature autophagosomes is temporally regulated by a PI4P-driven change in the surface charge of autophagosomes.

Abstract The degradation of cellular components plays an essential role in homeostasis. However, the known degradation pathways cannot account for the levels of proteolysis in cells. Here, we demonstrate that cytosolic proteins are imported into lysosomes in an ATP-dependent manner for degradation through a direct uptake mechanism distinct from any known pathway. SIDT2, a lysosomal membrane protein previously reported as an RNA transporter, translocates substrate proteins across the lysosomal membrane. Furthermore, we identify a dominant-negative mutation in SIDT2 that causes neuropathy and distal myopathy with rimmed vacuoles, a protein aggregation disease in humans. We generate Sidt2 knockout mice, recapitulating the characteristic features of this disease. Our results reveal a novel degradation pathway and illustrate its crucial role in cellular proteostasis, physiology, and pathophysiology. One Sentence Summary Discovery of a novel proteolytic pathway in cells, the dysfunction of which leads to protein aggregation disease in humans.