Macromolecular complexes are essential to conserved biological processes, but their prevalence across animals is unclear. By combining extensive biochemical fractionation with quantitative mass spectrometry, here we directly examined the composition of soluble multiprotein complexes among diverse metazoan models. Using an integrative approach, we generated a draft conservation map consisting of more than one million putative high-confidence co-complex interactions for species with fully sequenced genomes that encompasses functional modules present broadly across all extant animals. Clustering reveals a spectrum of conservation, ranging from ancient eukaryotic assemblies that have probably served cellular housekeeping roles for at least one billion years, ancestral complexes that have accrued contemporary components, and rarer metazoan innovations linked to multicellularity. We validated these projections by independent co-fractionation experiments in evolutionarily distant species, affinity purification and functional analyses. The comprehensiveness, centrality and modularity of these reconstructed interactomes reflect their fundamental mechanistic importance and adaptive value to animal cell systems. Using biochemical fractionation and mass spectrometry, animal protein complexes are identified from nine species in parallel, and, along with genome sequence information, complex conservation is investigated and over one million protein–protein interactions are predicted in 122 eukaryotes. Elucidating the components of multiprotein complexes on a proteome-wide scale has been aided by high-throughput methods for systematically determining protein–protein interactions. Here, Edward Marcotte and colleagues identify protein complexes from nine species in parallel, based on biochemical fractionation of native soluble macromolecular complexes followed by tandem mass spectrometry to identify components. The data, from roundworm, mouse, sea urchin, human, frog, fly, sea anemone, slime mould and yeast, show that many complexes are conserved across species. Combing the results with genome sequence information, the authors are able to predict more than one million interactions in 122 eukaryotes.

Abstract Macromolecular protein complexes carry out many of the essential functions of cells, and many genetic diseases arise from disrupting the functions of such complexes. Currently, there is great interest in defining the complete set of human protein complexes, but recent published maps lack comprehensive coverage. Here, through the synthesis of over 9,000 published mass spectrometry experiments, we present hu. MAP , the most comprehensive and accurate human protein complex map to date, containing > 4,600 total complexes, > 7,700 proteins, and > 56,000 unique interactions, including thousands of confident protein interactions not identified by the original publications. hu. MAP accurately recapitulates known complexes withheld from the learning procedure, which was optimized with the aid of a new quantitative metric ( k ‐cliques) for comparing sets of sets. The vast majority of complexes in our map are significantly enriched with literature annotations, and the map overall shows improved coverage of many disease‐associated proteins, as we describe in detail for ciliopathies. Using hu. MAP , we predicted and experimentally validated candidate ciliopathy disease genes in vivo in a model vertebrate, discovering CCDC 138, WDR 90, and KIAA 1328 to be new cilia basal body/centriolar satellite proteins, and identifying ANKRD 55 as a novel member of the intraflagellar transport machinery. By offering significant improvements to the accuracy and coverage of human protein complexes, hu. MAP ( http://proteincomplexes.org ) serves as a valuable resource for better understanding the core cellular functions of human proteins and helping to determine mechanistic foundations of human disease.

Hundreds of different cell types emerge in the developing embryo, each of which must compartmentalize cell type specific biochemical processes in a crowded intracellular environment. To study cell type specific compartmentalization, we examined motile ciliated cells, which must assemble vast numbers of dynein motors to drive ciliary beating, as mutation of dyneins or their assembly factors causes motile ciliopathy. We show that dyneins, their assembly factors, and chaperones all concentrate together in Dynein Assembly Particles (DynAPs). These phase-separated organelles are specific to ciliated cells but share machinery with stress granules. Our data suggest that a common framework underlies ubiquitous and cell-type specific phase separated organelles and that one such organelle is defective in a human genetic disease.

RNA-binding proteins (RBPs) play essential roles in biology and are frequently associated with human disease. While recent studies have systematically identified individual RBPs, their higher order assembly into Ribonucleoprotein (RNP) complexes has not been systematically investigated. Here, we describe a proteomics method for systematic identification of RNP complexes in human cells. We identify 1,428 protein complexes that associate with RNA, indicating that over 20% of known human protein complexes contain RNA. To explore the role of RNA in the assembly of each complex, we identify complexes that dissociate, change composition, or form stable protein-only complexes in the absence of RNA. Importantly, these data also provide specific novel insights into the function of well-studied protein complexes not previously known to associate with RNA, including replication factor C (RFC) and cytokinetic centralspindlin complex. Finally, we use our method to systematically identify cell-type specific RNA-associated proteins in mouse embryonic stem cells. We distribute these data as a resource, rna.MAP (rna.proteincomplexes.org) which provides a comprehensive dataset for the study of RNA-associated protein complexes. Our system thus provides a novel methodology for further explorations across human tissues and disease states, as well as throughout all domains of life.Summary An exploration of human protein complexes in the presence and absence of RNA reveals endogenous ribonucleoprotein complexes

The need to accurately survey proteins and their modifications with ever higher sensitivities, particularly in clinical settings with limited samples, is spurring development of new single molecule proteomics technologies. Fluorosequencing is one such highly parallelized single molecule peptide sequencing platform, based on determining the sequence positions of select amino acid types within peptides to enable their identification and quantification from a reference database. Here, we describe substantial improvements to fluorosequencing, including identifying fluorophores compatible with the sequencing chemistry, mitigating dye-dye interactions through the use of extended polyproline linkers, and developing an end-to-end workflow for sample preparation and sequencing. We demonstrate by fluorosequencing peptides in mixtures and identifying a target neoantigen from a database of decoy MHC peptides, highlighting the potential of the technology for high sensitivity clinical applications.

Abstract The beating of motile cilia requires to coordinated action of diverse machineries that include not only the axonemal dynein arms, but also the central apparatus, the radial spokes, and the microtubule inner proteins. These machines exhibit complex radial and proximodistal patterns in mature axonemes, but little is known about the interplay between them during motile ciliogenesis. Here, we describe and quantify the relative rates of axonemal deployment for these diverse cilia beating machineries during the final stages of differentiation of Xenopus epidermal multiciliated cells.

Macromolecular protein complexes carry out many of the essential functions of cells, and many genetic diseases arise from disrupting the functions of such complexes. Currently there is great interest in defining the complete set of human protein complexes, but recent published maps lack comprehensive coverage. Here, through the synthesis of over 9,000 published mass spectrometry experiments, we present hu.MAP, the most comprehensive and accurate human protein complex map to date, containing >4,600 total complexes, >7,700 proteins and >56,000 unique interactions, including thousands of confident protein interactions not identified by the original publications. hu.MAP accurately recapitulates known complexes withheld from the learning procedure, which was optimized with the aid of a new quantitative metric (k-cliques) for comparing sets of sets. The vast majority of complexes in our map are significantly enriched with literature annotations and the map overall shows improved coverage of many disease-associated proteins, as we describe in detail for ciliopathies. Using hu.MAP, we predicted and experimentally validated candidate ciliopathy disease genes in vivo in a model vertebrate, discovering CCDC138, WDR90, and KIAA1328 to be new cilia basal body/centriolar satellite proteins, and identifying ANKRD55 as a novel member of the intraflagellar transport machinery. By offering significant improvements to the accuracy and coverage of human protein complexes, hu.MAP (http://proteincomplexes.org) serves as a valuable resource for better understanding the core cellular functions of human proteins and helping to determine mechanistic foundations of human disease.

Multiciliated cells (MCCs) drive fluid flow in diverse tubular organs and are essential for development and homeostasis of the vertebrate central nervous system, airway, and reproductive tracts. These cells are characterized by dozens or hundreds of long, motile cilia that beat in a coordinated and polarized manner. Here, we explored the MCC ignorome by defining the subcellular localization of 260 poorly defined proteins in vertebrate MCCs in vivo. Moreover, functional analyses that arose from results of the screen provide novel insights into the mechanisms by which the actin cytoskeleton simultaneously influences diverse aspects of MCC biology, including basal body docking, and ciliogenesis.