Brain organoids are three-dimensionally reconstructed brain tissue derived from pluripotent stem cells in vitro. 3D tissue cultures have opened new avenues for exploring development and disease modeling. However, some physiological conditions, including signaling gradients in 3D cultures, have not yet been easily achieved. Here, we introduce Brain Organoid-on-a-Chip platforms that generate signaling gradients that in turn enable the induction of topographic forebrain organoids. This creates a more continuous spectrum of brain regions and provides a more complete mimic of the human brain for evaluating neurodevelopment and disease in unprecedented detail.

In developing brain neuronal migration, dendrite outgrowth and dendritic spine outgrowth are controlled by Cdc42, a small GTPase of the Rho family, and its activators. Cdc42 function in promoting actin polymerization is crucial for glutamatergic synapse regulation. Here, we focus on GABAergic synapse-specific activator of Cdc42, collybistin (CB) and examine functional differences between its splice isoforms CB1 and CB2. We report that CB1 and CB2 differentially regulate GABAergic synapse formation in vitro along proximal-distal axis and adult-born neuron maturation in vivo. The functional specialization between CB1 and CB2 isoforms arises from their differential protein half-life, in turn regulated by ubiquitin conjugation of the unique CB1 C-terminus. We report that CB1 and CB2 negatively regulate Cdc42; however, Cdc42 activation is dependent on CB interaction with gephyrin. During hippocampal adult neurogenesis CB1 regulates neuronal migration, while CB2 is essential for dendrite outgrowth. Finally, using mice lacking Gabra2 subunit, we show that CB1 function is downstream of GABAARs, and we can rescue adult neurogenesis deficit observed in Gabra2 KO. Overall, our results uncover previously unexpected role for CB isoforms downstream of α2-containing GABAARs during neuron maturation in a Cdc42 dependent mechanism.

Abstract Sleep/wake cycles intricately shape physiological activities including cognitive brain functions, yet the precise molecular orchestrators of sleep remain elusive. Notably, the clinical impact of benzodiazepine drugs underscores the pivotal role of GABAergic neurotransmission in sleep regulation. However, the specific contributions of distinct GABA A receptor subtypes and their principal scaffolding protein, gephyrin, in sleep dynamics remain unclear. The evolving role of synaptic phospho‐proteome alterations at excitatory and inhibitory synapses suggests a potential avenue for modulating gephyrin and, consequently, GABA A Rs for sleep through on‐demand kinase recruitment. Our study unveils the distinctive roles of two prevalent GABA A receptor subtypes, α1‐ and α2‐GABA A Rs, in influencing sleep duration and electrical sleep activity. Notably, the absence of α1‐GABA A Rs emerges as central in sleep regulation, manifesting significant alterations in both non‐rapid eye movement (NREM) and rapid eye movement (REM) sleep during dark or active phases, accompanied by altered electroencephalogram (EEG) patterns across various frequencies. Gephyrin proteomics analysis reveals sleep/wake‐dependent interactions with a repertoire of known and novel kinases. Crucially, we identify the regulation of gephyrin interaction with ERK1/2, and phosphorylations at serines 268 and 270 are dictated by sleep/wake cycles. Employing AAV‐eGFP‐gephyrin or its phospho‐null variant (S268A/S270A), we disrupt sleep either globally or locally to demonstrate gephyrin phosphorylation as a sleep regulator. In summary, our findings support the local cortical sleep hypothesis and we unveil a molecular mechanism operating at GABAergic synapses, providing critical insights into the intricate regulation of sleep.

Abstract A diverse set of GABA A receptors (GABA A Rs) enable synaptic plasticity adaptations at inhibitory postsynaptic sites in collaboration with the scaffolding protein gephyrin. Early studies helped to identify distinctions between GABA A R subtypes allocated within specific functional circuits, but their contribution to the changing dynamics of a microcircuit remains unclear. Here, using the whisker-barrel system in mouse, we assessed the contribution of specific synaptic GABA A R subtypes and gephyrin scaffolding changes to sensory processing in vivo . We monitored spontaneous and evoked Ca 2+ transients in layer 2/3 pyramidal cells with the genetically encoded Ca 2+ sensor RCaMP1.07. Using Gabra1 or Gabra2 global and conditional knockout mice, we uncovered that α1- and α2-GABA A Rs determine the sparseness of L2/3 pyramidal neuron encoding. In a cell-type dependent manner, α1-GABA A Rs and α2-GABA A Rs affected neuronal excitability and the reliability of neuronal responses after whisker stimulation. We also discerned that gephyrin with its diverse post-translational modifications (PTMs) shows preference for specific GABA A R subtype to facilitate microcircuit activity. Our results underscore the relevance of the diversity of GABA A Rs within a cortical microcircuit. Key points While GABAergic inhibition from interneuron subtypes regulates cortical microcircuit activity the molecular determinants have remain unclear. We demonstrate that specific-GABA A receptor subtypes contribute differentially to layer 2/3 neuronal activities in mouse barrel cortex. Importantly, we link the GABAAR contributions to the scaffolding properties of its important postsynaptic density protein gephyrin. We show that different PTMs on gephyrin determines neuronal excitability via GABAAR recruitment and modulation of inhibition within layer 2/3 neurons. Specifically, α1 and α2 subunits containing GABA A receptors, along with their scaffolding protein gephyrin determine the distribution of high, medium and low activity pyramidal neurons during sensory encoding, whereby controlling the total activity of cortical microcircuit.