Abstract Atherosclerotic plaque formation is driven by the continued expansion of cholesterol loaded ‘foamy’ macrophages within the arterial intima. Foamy macrophages are primarily derived from newly recruited monocytes, but factors regulating monocyte specification toward foamy macrophage differentiation and prolonged survival in plaque remain poorly understood. We used trajectory analysis of integrated single cell RNA-seq data, along with a genome-wide CRISPR screening approach to identify Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2 (Trem2) as a candidate regulator for foamy macrophage specification. Loss of Trem2 led to a reduced ability of foamy macrophages to take up additional oxidized low density lipoprotein (LDL) cholesterol in vitro. Competitive chimera experiments showed that Trem2-deficient macrophages were less competent to form foamy macrophages when competed against Trem2-sufficient macrophages in vivo. In addition, myeloid specific conditional deletion of Trem2 resulted in a dramatic attenuation of plaque progression, even when targeted in established atherosclerotic lesions. This was independent of changes in circulating inflammatory cytokines, monocyte recruitment, or serum cholesterol levels, but due to a reduction in plaque macrophage proliferation and enhanced cell death. Mechanistically, we link Trem2-deficient macrophages with an inability for cells to sense cholesterol loading and failure to upregulate efflux molecules. Accumulation of cholesterol in the endoplasmic reticulum enhanced activation of the ER-stress response that increased susceptibility for cholesterol-toxicity and cell death in foamy Trem2-deficient macrophages. Overall, this study identifies Trem2 as a regulator of foamy macrophage differentiation, atherosclerotic plaque growth, and as a putative therapeutic target for future intervention studies.

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arteries that is a major cause of cardiovascular disease (CVD). Atherosclerotic plaque progression is driven by the deposition of low-density lipoprotein (LDL) within the intima, which is internalized by macrophages, forming lipid-engorged foamy cells. Importantly, the accumulation of excess LDL within foamy macrophages is cytotoxic, driving apoptosis, which ultimately promotes necrotic core formation and increased potential for plaque rupture. Recently, our lab identified the lipid receptor Trem2 to be highly expressed by foamy macrophages and regulate cell survival, proliferation, and cholesterol efflux. Thus, we tested whether agonizing Trem2 could drive macrophage survival to promote plaque stability. Using a Trem2 agonist antibody (AL002a, Alector Inc.), we treated Ldlr -/- mice that had preexisting atherosclerotic plaque with either isotype control or AL002a antibody for 8 weeks. AL002a treated mice showed an increase in plaque size in the aortic arch and aortic sinus. Plaque analysis determined that this was primarily due to an expansion of macrophage cellularity, through promotion of cell survival and proliferation. Furthermore, we found that plaques from AL002a treated mice had decreased necrotic core formation, increased fibrous cap size, and increased collagen deposition, consistent with improved stability. Single cell RNA-sequencing of atherosclerotic aortae from isotype and AL002a treated mice found that Trem2-agonism dramatically reshaped transcriptomes of both foamy macrophages and smooth muscle cells, including upregulation of oxidative phosphorylation (OXPHOS), cholesterol efflux, collagen, and pro-survival genes while downregulating inflammatory pathways. In vitro studies using bone marrow derived macrophages confirmed AL002a’s ability to drive cell survival, proliferation, OXPHOS, and cholesterol efflux in culture. Finally, we determined that AL002a’s ability to reshape aspects of foamy macrophage function was dependent on its ability to activate the kinase SYK downstream of Trem2. Overall, this data identifies Trem2 as a viable therapeutic target for promoting atherosclerotic plaque stability and improving outcomes in CVD.

Recruited monocytes that subsequently differentiate into macrophages within atherosclerotic lesions are a primary driver of plaque progression and a risk factor for rupture. Advances in single cell RNA sequencing have expanded our understanding of macrophage diversity within plaques. However, limited analysis has explored regulators of monocyte lineage commitment and spatial localization in atherosclerotic plaque. Examining scRNAseq gene expression data of plaque-associated monocyte and macrophage lineages, pseudotime trajectory analysis predicted a binary fate decision by monocytes differentiating toward either an inflammatory or lipid-loaded “foamy” differentiation state. Foamy state was associated with lipid processing genes ( Fabp5, Lgals3, Trem2 ), whereas inflammatory state was associated with inflammasome genes ( Il1b, Nlrp3 ) and chemokines ( Ccl3, Ccl4 ). To test the in silico analysis, we established a monocyte fate mapping approach using a tamoxifen-inducible reporter mouse (CCR2 creERT2 Rosa26 lsl-tdTomato ) and performed kinetic analysis of tdTomato+ cells within plaque. tdTomato-labeled cells could be found shortly after tamoxifen treatment with small, rounded morphology, consistent with newly recruited monocytes. Within days, small, rounded cells were absent and labeled cells appeared to be lipid loaded with bloated morphology. Immunostaining revealed inflammasome activation in a large subset of monocytes immediately following recruitment to lesions. However, IL-1b hi cells were no longer detectable days after recruitment. Together, these data support a model where recruited monocytes commit toward either inflammatory or foamy lineage immediately upon plaque entry. Further, data support that inflammatory cells are short lived in atherosclerotic plaques, whereas foamy cells persist for longer periods of time. Ongoing work in our lab will address the role of known foamy macrophage regulators, including Trem2, in modulating fate commitment of monocytes entering early and late stage atherosclerotic lesions. Understanding the spatial-temporal dynamics of monocyte recruitment and differentiation will illuminate new mechanisms of atherosclerosis progression and potential therapeutic targets.

Abstract Objective Trem2, a surface lipid receptor, is expressed on foamy macrophages within atherosclerotic lesions and regulates cell survival, proliferation, and anti-inflammatory responses. Studies examining the role of Trem2 in atherosclerosis have shown that deletion of Trem2 leads to impaired foamy macrophage lipid uptake, proliferation, survival, and cholesterol efflux. Thus, we tested the hypothesis that administration of a validated Trem2 agonist antibody (AL002a) to atherogenic mice could drive macrophage survival and decrease necrotic core formation to improve plaque stability. Approach and Results To model a therapeutic intervention approach, atherosclerosis-prone mice (Ldlr -/- ) were fed a high fat diet (HFD) for 8 weeks, then transitioned to treatment with AL002a or isotype control for an additional 8 weeks while continuing on an HFD. AL002a-treated mice had increased lesion size in both the aortic sinus and whole mount aorta, which correlated with an expansion of plaque macrophage area. This expansion was due to increased macrophage survival and proliferation in plaques. Importantly, plaques from AL002a-treated mice showed improved features of plaque stability, including smaller necrotic cores, increased fibrous caps, and greater collagen deposition. Single cell RNA sequencing of whole aorta suspensions from isotype and AL002a-treated atherosclerotic mice revealed that Trem2 agonism dramatically altered foamy macrophage transcriptome. This included upregulation of oxidative phosphorylation and increased expression of collagen genes. In vitro studies validated that Trem2-agonism with AL002a promoted foamy macrophage oxLDL uptake, survival, and cholesterol efflux in culture. Conclusions Trem2 agonist expands plaque macrophages by promoting cell survival and proliferation but improves features of plaque stability by rewiring foamy macrophage function to enhance collagen deposition.

Summary Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a lethal malignancy resistant to immunotherapy. The pancreatic tumor microenvironment is shaped and maintained by myeloid cells that outnumber tumor cells. Here, using monocyte fate-mapping PDA mouse models and human tumor tissues, we identify monocytes give rise to most heterogeneous macrophage subpopulations in PDA. We show that monocyte differentiation is governed by the local presence of CD4, but not CD8, T cells. We demonstrate that tumor specific CD4 T cells induce monocyte differentiation into antitumor MHCII hi proinflammatory macrophages dependent on non-redundant IFNγ and CD40 signaling pathways that suppress tumor growth. Pancreatic tissue-resident macrophages exhibit an immunosuppressive pro-tumor state that is refractory to the modulatory effects of antitumor CD4 T cells. Intratumoral monocytes adopt a pro-tumor fate indistinguishable from tissue-resident macrophages following CD4 T cell depletion. Thus, tumor-specific CD4 T cell governance of monocyte fate promotes immune-mediated control of solid tumors. Highlights ▪ Circulating monocytes are progenitors to most heterogeneous macrophage subsets in PDA ▪ Monocyte-derived macrophage acquisition of an MHCII hi phenotype is dependent on tumor-specific CD4 T cells ▪ In the absence of CD4 T cells, monocyte-derived macrophages acquire tissue resident macrophage traits and tumors rapidly progress ▪ IFNγ and CD40 signaling are nonredundant and critical determinants of intratumoral monocyte fate