Abstract Bacteria carry out sophisticated developmental programs to colonize exogenous surfaces. The rotary flagellum, a dynamic machine that drives motility, is a key regulator of surface colonization. The specific signals recognized by flagella and the pathways by which those signals are transduced to coordinate adhesion remain subjects of debate. Mutations that disrupt flagellar assembly in the dimorphic bacterium Caulobacter crescentus stimulate the production of a polysaccharide adhesin called the holdfast. Using a genome-wide phenotyping approach, we compared surface adhesion profiles in wild-type and flagellar mutant backgrounds of C. crescentus . We identified a diverse set of flagellar mutations that enhance adhesion by inducing a hyper-holdfast phenotype and discovered a second set of mutations that suppress this phenotype. Epistasis analysis of the flagellar signaling suppressor ( fss ) mutations demonstrated that the flagellum stimulates holdfast production via two genetically distinct pathways. The developmental regulator PleD contributes to holdfast induction in mutants disrupted at both early and late stages of flagellar assembly. Mutants disrupted at late stages of flagellar assembly, which assemble an intact rotor complex, induce holdfast production through an additional process that requires the MotAB stator and its associated diguanylate cyclase, DgcB. We have assigned a subset of the fss genes to either the stator- or pleD -dependent networks and characterized two previously unidentified motility genes that regulate holdfast production via the stator complex. We propose a model through which the flagellum integrates mechanical stimuli into the C. crescentus developmental program to coordinate adhesion. Importance Understanding how bacteria colonize solid surfaces is of significant clinical, industrial and ecological importance. In this study, we identified genes that are required for Caulobacter crescentus to activate surface attachment in response to signals from a macromolecular machine called the flagellum. Genes involved in transmitting information from the flagellum can be grouped into separate pathways, those that control the C. crescentus morphogenic program and those that are required for flagellar motility. Our results support a model in which a developmental and a mechanical signaling pathway operate in parallel downstream of the flagellum and converge to regulate adhesion. We conclude that the flagellum serves as a signaling hub by integrating internal and external cues to coordinate surface colonization and emphasize the role of signal integration in linking complex sets of environmental stimuli to individual behaviors.

ABSTRACT Bacterial genomes evolve in complex ecosystems and are best understood in this natural context, but replicating such conditions in the lab is challenging. We used transposon sequencing to define the fitness consequences of gene disruption in the bacterium Caulobacter crescentus grown in natural freshwater, compared to axenic growth in common laboratory media. Gene disruptions in amino acid and nucleotide biosynthesis pathways and in metabolic substrate transport machinery impaired fitness in both lake water and defined minimal medium relative to complex peptone broth. Fitness in lake water was enhanced by insertions in genes required for flagellum biosynthesis and reduced by insertions in genes involved in biosynthesis of the holdfast surface adhesin. We further uncovered numerous hypothetical and uncharacterized genes for which disruption impaired fitness in lake water, defined minimal medium, or both. At the genome scale, the fitness profile of mutants cultivated in lake water was more similar to that in complex peptone broth than in defined minimal medium. Microfiltration of lake water did not significantly affect the terminal cell density or the fitness profile of the transposon mutant pool, suggesting that Caulobacter does not strongly interact with other microbes in this ecosystem on the measured timescale. Fitness of select mutants with defects in cell surface biosynthesis and environmental sensing were significantly more variable in lake water than in defined medium, presumably owing to day-to-day heterogeneity in the lake environment. This study reveals genetic interactions between Caulobacter and a natural freshwater environment, and provides a new avenue to study gene function in complex ecosystems.

Abstract Two-component signaling systems (TCSs) are comprised of a sensory histidine kinase and a response regulator protein. In response to environmental changes, sensor kinases directly phosphorylate their cognate response regulator to affect gene expression. Bacteria typically express multiple TCSs that are insulated from one another and regulate distinct physiological processes. There are certainly examples of cross-regulation between TCSs, but this phenomenon remains relatively unexplored. We have identified regulatory links between the ChvG–ChvI (ChvGI) and NtrY–NtrX (NtrYX) TCSs, which control important and often overlapping processes in α-proteobacteria, including maintenance of the cell envelope. Deletion of chvG and chvI in Caulobacter crescentus limited growth in defined medium and a selection for genetic suppressors of this growth phenotype uncovered interactions among chvGI, ntrYX , and ntrZ , which encodes a previously uncharacterized periplasmic protein. Significant overlap in the experimentally-defined ChvI and NtrX transcriptional regulons provided support for the observed genetic connections between ntrYX and chvGI . Moreover, we present evidence that the growth defect of strains lacking chvGI is influenced by the phosphorylation state of NtrX and, to some extent, by levels of the TonB-dependent receptor ChvT. Measurements of NtrX phosphorylation in vivo indicated that NtrZ is an upstream regulator of NtrY, and that NtrY primarily functions as an NtrX phosphatase. We propose a model in which NtrZ functions in the periplasm to inhibit NtrY phosphatase activity; regulation of phosphorylated NtrX levels by NtrZ and NtrY provides a mechanism to modulate and balance expression of the NtrX and ChvI regulons under different growth conditions. Importance Two-component signaling systems (TCSs) enable bacteria to regulate gene expression in response to physiochemical changes in their environment. The ChvGI and NtrYX TCSs regulate diverse pathways associated with pathogenesis, growth, and cell envelope function in many α-proteobacteria. We used Caulobacter crescentus as a model to investigate regulatory connections between ChvGI and NtrYX. Our work defined the ChvI transcriptional regulon in C. crescentus and revealed a genetic interaction between ChvGI and NtrYX, whereby modulation of NtrYX signaling affects the survival of cells lacking ChvGI. In addition, we identified NtrZ as a periplasmic inhibitor of NtrY phosphatase activity in vivo . Our work establishes C. crescentus as an excellent model to investigate multi-level regulatory connections between ChvGI and NtrYX in α-proteobacteria.

Abstract In aquatic environments, Caulobacter spp. are often present at the boundary between liquid and air known as the neuston. I report an approach to study temporal features of Caulobacter crescentus colonization and pellicle biofilm development at the air-liquid interface, and have defined the role of cell surface structures in this process. At this interface, C. crescentus initially forms a monolayer of cells bearing a surface adhesin known as the holdfast. When excised from the liquid surface, this monolayer strongly adheres to glass. The monolayer subsequently develops into a three-dimensional structure that is highly enriched in clusters of stalked cells known as rosettes. As this pellicle film matures, it becomes more cohesive and less adherent to a glass surface. A mutant strain lacking a flagellum does not efficiently reach the surface, and strains lacking type IV pili exhibit defects in organization of the three-dimensional pellicle. Strains unable to synthesize holdfast fail to accumulate at the boundary between air and liquid and do not form a pellicle. Phase contrast images support a model whereby the holdfast functions to trap C. crescentus cells at the air-liquid boundary. Unlike the holdfast, neither the flagellum nor type IV pili are required for C. crescentus to partition to the air-liquid interface. While it is well established that the holdfast enables adherence to solid surfaces, this study provides evidence that the holdfast has physicochemical properties required for partitioning of non-motile mother cells to the air-liquid interface, which facilitates colonization of this microenvironment. Importance In aquatic environments the boundary at the air interface is often highly enriched with nutrients and oxygen. Colonization of this niche likely confers a significant fitness advantage in many cases. This study provides evidence that the cell surface adhesin known as a holdfast enables Caulobacter crescentus to partition to and colonize the air-liquid interface. Additional surface structures including the flagellum and type IV pili are important determinants of colonization and biofilm formation at this boundary. Considering that holdfast-like adhesins are broadly conserved in Caulobacter spp. and other members of the diverse class Alphaproteobacteria , these surface structures may function broadly to facilitate colonization of air-liquid boundaries in a range of ecological contexts including freshwater, marine, and soil ecosystems.

Molecular components of the Brucella abortus cell envelope, including lipopolysaccharide, play a major role in its ability to infect, colonize and survive inside mammalian host cells. We have defined a role for a conserved gene of unknown function in B. abortus envelope stress resistance and infection. Expression of this gene, which we name eipA, is directly activated by the essential cell cycle regulator, CtrA. eipA encodes a soluble periplasmic protein that adopts an unusual eight-stranded β-barrel fold. Deletion of eipA attenuates replication and survival in macrophage and mouse infection models, and results in sensitivity to cell envelope stressors in vitro. Transposon disruption of genes required for LPS O-polysaccharide biosynthesis is synthetically lethal with eipA deletion. This genetic connection between O-polysaccharide and eipA is corroborated by our discovery that eipA is essential in Brucella ovis, a rough species that harbors mutations in several genes required for O-polysaccharide production. Conditional depletion of eipA expression in B. ovis results in a cell chaining phenotype, providing evidence that eipA directly or indirectly influences cell division in Brucella. Our data provide evidence that EipA is a molecular determinant of Brucella virulence that functions to maintain cell envelope integrity and influences cell division.

Two-component signaling systems (TCSs) function to detect environmental cues and transduce this information into a change in transcription. In its simplest form, TCS-dependent regulation of transcription entails phosphoryl-transfer from a sensory histidine kinase to its cognate DNA-binding receiver protein. However, in certain cases, auxiliary proteins may modulate TCSs in response to secondary environmental cues. Caulobacter crescentus FixT is one such auxiliary regulator. FixT is composed of a single receiver domain and functions as a feedback inhibitor of the FixL-FixJ (FixLJ) TCS, which regulates the transcription of genes involved in adaptation to microaerobiosis. We sought to define the impact of fixT on Caulobacter cell physiology and to understand the molecular mechanism by which FixT represses FixLJ signaling. fixT deletion results in excess production of porphyrins and premature entry into stationary phase, demonstrating the importance of feedback inhibition of the FixLJ signaling system. Although FixT is a receiver domain, it does not affect dephosphorylation of the oxygen-sensor kinase FixL or phosphoryltransfer from FixL to its cognate receiver FixJ. Rather, FixT represses FixLJ signaling by inhibiting the FixL autophosphorylation reaction. We have further identified a 4-cysteine motif in Caulobacter FixT that binds an Fe-S cluster and protects the protein from degradation by the Lon protease. Our data support a model in which oxidation of this Fe-S cluster promotes degradation of FixT in vivo . This proteolytic mechanism facilitates clearance the of the FixT feedback inhibitor from the cell under normoxia and resets the FixLJ system for a future microaerobic signaling event.Importance Two-component signal transduction systems (TCSs) are broadly conserved in the bacterial kingdom and generally contain two molecular components: a sensor histidine kinase and a receiver protein. Sensor histidine kinases alter their phosphorylation state in direct response to a physical or chemical cue, whereas receiver proteins “receive” the phosphoryl group from the kinase to regulate a change in cell physiology. We have discovered that a single-domain receiver protein, FixT, binds an Fe-S cluster and controls Caulobacter heme homeostasis though its function as a negative feedback regulator of the oxygen-sensor kinase, FixL. We provide evidence that the Fe-S cluster protects FixT from Lon-dependent proteolysis in the cell and endows FixT with the ability to function as a second, autonomous oxygen/redox sensor in the FixL-FixJ signaling pathway. This study introduces a novel mechanism of regulated TCS feedback control by an Fe-S-binding receiver domain.

Surface colonization is central to the lifestyles of many bacteria. Exploiting surface niches requires sophisticated systems for sensing and attaching to solid materials. Caulobacter crescentus synthesizes a polysaccharide-based adhesin known as the holdfast at one of its cell poles, which enables tight attachment to exogenous surfaces. The genes required for holdfast biosynthesis have been analyzed in detail, but an inability to isolate sufficient quantities of holdfast has limited efforts to characterize its composition and structure. In this report we describe a method to extract the holdfast from C. crescentus cultures and present a survey of its carbohydrate content. Glucose, 3-O-methylglucose, mannose, N-acetylglucosamine and xylose were detected in our extracts. Our results suggest that the holdfast contains a 1,4-linked backbone of glucose, mannose, N-acetylglucosamine and xylose that is decorated with branches at the C-6 positions of glucose and mannose. By defining the monosaccharide components in the polysaccharide, our work establishes a framework for characterizing enzymes in the holdfast pathway and provides a broader understanding of how polysaccharide adhesins are built.

Cells adapt to shifts in their environment by remodeling transcription. Measuring changes in transcription at the genome scale is now routine, but defining the functional significance of individual genes within large gene expression datasets remains a major challenge. We applied a network-based algorithm to interrogate publicly available transcription data to predict genes that serve major functional roles in Caulobacter crescentus stress survival. This approach identified GsrN, a conserved small RNA that is directly controlled by the general stress sigma factor, σT, and functions as a potent post-transcriptional regulator of survival under multiple stress conditions. GsrN expression is both necessary and sufficient to protect cells from hydrogen peroxide, where it functions by base pairing with the leader of katG mRNA and promoting catalase/peroxidase expression. We conclude that GsrN convenes a post-transcriptional layer of gene expression that serves a central functional role in stress physiology.

The Brucella abortus general stress response sigma factor, σE1, directly and indirectly regulates the transcription of dozens of genes that influence stress survival and host infection. Characterizing the functions of σE1-regulated genes therefore contributes to understanding of B. abortus physiology and infection biology. Transcription of the IclR family regulator, Bab2_0215, is indirectly activated by σE1 but its function remains undefined. We present a structural and functional characterization of Bab2_0215, which we have named Brucella adipic acid activated regulator (BaaR). BaaR adopts a classic IclR-family fold and directly regulates the transcription of two operons with predicted roles in carboxylic acid oxidation. BaaR binds two sites on chromosome II between baaR and a divergently transcribed hydratase/dehydrogenase (acaD2), and represses transcription. We identified three carboxylic acids (adipic acid tetradecanedioic acid, ε-aminocaproic acid) and a lactone (ε-caprolactone) that enhance transcription from the baaR and acaD2 promoters. However, neither the activating acids nor caprolactone enhance transcription by binding directly to BaaR. Induction of baaR transcription by adipic acid requires the gene bab2_0213, which encodes a major facilitator superfamily transporter, suggesting that Bab2_0213 transports adipic acid across the inner membrane. We conclude that a set of structurally related organic molecules activate transcription of genes repressed by BaaR. Our study provides molecular-level understanding of a gene expression program regulated downstream of σE1.

Summary The Gram-negative cell envelope is a remarkably diverse structure with core components that include an inner membrane, an outer membrane, and a peptidoglycan layer in the periplasmic space between. We show that a conserved DUF1849-family protein, EipB, is secreted to the periplasmic space of Brucella , a monophyletic group of intracellular pathogens. In the periplasm, EipB folds into an unusual fourteen-stranded β-spiral structure that contains a conserved disulfide bond. EipB has structural features that resemble the LolA and LolB lipoprotein delivery system, though the overall topology and fold of EipB is distinct from LolA/LolB. Deletion of eipB results in defects in both cell envelope integrity in vitro and in maintenance of spleen colonization in a mouse model of B. abortus infection. Transposon disruption of ttpA , which encodes a periplasmic tetratricopeptide repeat (TPR) protein, is synthetically lethal with eipB deletion in B. abortus . ttpA is a known virulence determinant in B. melitensis , and our studies of ttpA deletion and overexpression strains provide evidence that ttpA , like eipB , contributes to cell envelope function in Brucella . We conclude that eipB and ttpA function in the Brucella periplasmic space to maintain cell envelope integrity and to facilitate survival in a mammalian host. Importance Brucella species cause brucellosis, a global zoonosis. A gene encoding a conserved uncharacterized protein, EipB, is present in all sequenced Brucella and several other genera in the class Alphaproteobacteria. To our knowledge, this study presents the first functional and structural characterization of a protein from the DUF1849 family, to which EipB belongs. EipB is secreted to the periplasm where it forms a spiral-like anti-parallel β structure. Deletion of Brucella eipB results in defects of the cell envelope and in reduced virulence in an animal model of disease. eipB genetically interacts with ttpA , which also encodes a periplasmic protein. We propose that EipB and TtpA function as part of a system required for cell envelope homeostasis in select Alphaproteobacteria .