Cognitive processes require working memory (WM) that involves a brief period of memory retention known as the delay period. Elevated delay-period activity in the medial prefrontal cortex (mPFC) has been observed, but its functional role in WM tasks remains unclear. We optogenetically suppressed or enhanced activity of pyramidal neurons in mouse mPFC during the delay period. Behavioral performance was impaired during the learning phase but not after the mice were well trained. Delay-period mPFC activity appeared to be more important in memory retention than in inhibitory control, decision-making, or motor selection. Furthermore, endogenous delay-period mPFC activity showed more prominent modulation that correlated with memory retention and behavioral performance. Thus, properly regulated mPFC delay-period activity is critical for information retention during learning of a WM task.

Abstract Deciphering patterns of connectivity between neurons in the brain is a critical step toward understanding brain function. Imaging-based neuroanatomical tracing identifies area-to-area or sparse neuron-to-neuron connectivity patterns, but with limited throughput. Barcode-based connectomics maps large numbers of single-neuron projections, but remains a challenge for jointly analyzing single-cell transcriptomics. Here, we established a rAAV2-retro barcode-based multiplexed tracing method that simultaneously characterizes the projectome and transcriptome at the single neuron level. We uncovered dedicated and collateral projection patterns of ventromedial prefrontal cortex (vmPFC) neurons to five downstream targets and found that projection-defined vmPFC neurons are molecularly heterogeneous. We identified transcriptional signatures of projection-specific vmPFC neurons, and verified Pou3f1 as a marker gene of neurons extending collateral branches to dorsomedial striatum and lateral hypothalamus. In summary, we have developed a new multiplexed technique whose paired connectome and gene expression data can help reveal organizational principles that form neural circuits and process information.

The cortico-basal ganglia-thalamus (CBT) loop is important for behavior. However, the activity and learning-related modulation within the loop in behavior remain unclear. To tackle this problem, we trained mice to perform a delayed sensorimotor-transformation task and recorded single-unit activity during learning simultaneously from four regions in a CBT loop: prelimbic area (PrL), posterior premotor cortex (pM2), dorsomedial caudate/putamen (dmCP), and mediodorsal thalamus (MD). Sensory and decision related information were encoded by the neurons within the loop, with weak interaction among neurons of different coding ability. The functional interaction among regions within the loop was dynamically routed in the loop during different behavioral phases and contributed to explain decision-related neuronal activity. The neurons of PrL and dmCP exhibited learning-related reorganization in neuronal activity and more persistent coding of sensory and decision-related information. Thus, both sensory- and decision-related information are processed in a functionally interacted CBT loop that is modulated by learning.

SUMMARY Dopamine significantly modulates working memory (WM) 1–8 , a fundamental cognitive function that maintains information during a brief delay period 9–11 . The temporal precision of dopaminergic modulation in WM and related neural mechanisms remain elusive. Here we unveiled the pivotal role of dopamine timing in WM performance with head-fixed mice engaged in learning an olfactory WM task. Through electrophysiology and optogenetics, we found that dopaminergic neurons in the ventral tegmental area (VTA) could encode WM information during the delay period, and manipulating dopaminergic neuronal activity bidirectionally modulated WM performance in an inverted U-shaped manner. Optogenetic manipulation of VTA activity also induced bidirectional changes in WM-related neural activity in the medial prefrontal cortex (mPFC). Imaging with a dopamine-sensitive GPCR-activation-based sensor (GRAB DA ) 12,13 revealed transient dopamine peaks in the mPFC specifically during the early-delay period. Optogenetic stimulation of VTA-to-mPFC dopaminergic projections during the early- and late-delay period enhanced and impaired WM performance, respectively. Manipulations outside these periods or involving the nucleus accumbens had no effect. Single-unit recordings demonstrated that optogenetic excitation of VTA-to-mPFC projections could modulate mPFC neuronal activity in a manner consistent with behavioral modulation. Thus, the timing of dopamine release is critical in modulation of neuronal activity and behavior.

Abstract Understanding neuronal mechanisms of cognitive behaviors requires efficient behavioral assays. We designed a high-throughput automatic training system (HATS) for olfactory behaviors in head-fixed mice. The hardware and software were constructed to enable automatic training with minimal human intervention. The integrated system was composed of customized 3D-printing supporting components, an odor-delivery unit with fast response, Arduino based hardware-controlling and data-acquisition unit. Furthermore, the customized software was designed to enable automatic training in all training phases, including lick-teaching, shaping, and learning. Using HATS, we trained mice to perform delayed non-match to sample (DNMS), delayed paired association (DPA), Go/No-go (GNG), and GNG reversal tasks. These tasks probed cognitive functions including sensory discrimination, working memory, decision making, and cognitive flexibility. Mice reached stable levels of performance within several days in the tasks. HATS enabled an experimenter to train eight mice simultaneously, therefore greatly enhanced the experimental efficiency. Combined with causal perturbation and activity recording techniques, HATS can greatly facilitate our understanding of the neural-circuitry mechanisms underlying cognitive behaviors.

SUMMARY Short-term memory (STM) maintains information during a short delay period. How long-range and local connections interact to support STM encoding remains elusive. Here we tackled the problem focusing on long-range projections from medial prefrontal cortex (mPFC) to anterior agranular insular cortex (aAIC) in head-fixed mice performing an olfactory delayed-response task. Optogenetic and electrophysiological experiments revealed behavioral importance of the two regions in encoding STM information. Spike-correlogram analysis revealed strong local and cross-region functional coupling (FC) between memory neurons encoding the same information. Optogenetic suppression of mPFC-aAIC projections during the delay period reduced behavioral performance, the proportion of memory neurons and memory-specific FC within aAIC, whereas optogenetic excitation enhanced all of them. MPFC-to-aAIC projections also bidirectionally modulated efficacy of STM-information transfer, measured by contribution of FC spiking pairs to coding ability of following neurons. Thus, prefrontal projections modulate functional connectivity and coding ability of insular neurons to support short-term memory.

Abstract How does millisecond-scale neural activity mediate behaviors over seconds? We recorded brain-wide activity in mice performing an olfactory working-memory task to decipher cross-region organization of activity. Spike-correlograms revealed millisecond within- and cross-region spike couplings, more prominent among neurons encoding similar memories. Spike coupling linked neurons into motifs of chains, single loops, and nested loops, especially among hippocampal and prefrontal-cortex neurons. Direction of spike coupling and activity chains was in line with that of memory-associated activity waves. Intriguingly, activity motifs were replayed before and after task performance, and during inter-trial intervals. Motifs were hierarchically organized, with progressively increasing time constants and the number of participating neurons. Thus, hierarchically organized and replayed cross-region spiking motifs are modulated on demand during delay period to mediate perceptual working memory. One Sentence Summary Nested activity motifs of chains, single loops, and nested loops, with progressively increasing time constants and number of participating neurons, are hierarchically organized and replayed to mediate perceptual working-memory maintenance.