Abstract Work of the past three decades provided tremendous insight into the regulation of K + channels - in particular K ir channels - by polyanionic lipids of the phosphoinositide (e.g. PIP 2 ) and fatty acid metabolism (e.g. oleoyl-CoA). However, comparatively little is known regarding the phosphoinositide regulation in the K 2P channel family and the effects of long-chain fatty acid CoA esters (LC-CoA, e.g. oleoyl-CoA) are so far unexplored. By screening most mammalian K 2P channels (12 in total), we report strong effects of polyanionic lipids (activation and inhibition) for all tested K 2P channels. In most cases the effects of PIP 2 and oleoyl-CoA were similar causing either activation or inhibition depending on the respective subgroup. Activation was observed for members of the TREK, TALK and THIK subfamily with the strongest activation by PIP 2 seen for TRAAK (~110-fold) and by oleoyl-CoA for TALK-2 (~90-fold). In contrast, inhibition was observed for members of the TASK and TRESK subfamilies up to ~85 %. In TASK-2 channels our results indicated an activatory as well as an inhibitory PIP 2 site with different affinities. Finally, we provided evidence that PIP 2 inhibition in TASK-1 and TASK-3 channels is mediated by closure of the recently identified lower X-gate as critical mutations within the gate (i.e. L244A, R245A) prevent PIP 2 induced inhibition. Our results disclosed K 2P channels as a family of ion channels highly sensitive to polyanionic lipids (PIP 2 and LC-CoA), extended our knowledge on the mechanisms of lipid regulation and implicate the metabolisms of these lipids as possible effector pathways to regulate K 2P channel activity.

Abstract The two-pore domain potassium (K 2P ) channels TREK-1 and TREK-2 link neuronal excitability to a variety of stimuli including mechanical force, lipids, temperature and phosphorylation. This regulation involves the C-terminus as a polymodal stimulus sensor and the selectivity filter (SF) as channel gate. Using crystallographic up- and down-state structures of TREK-2 as a template for full atomistic molecular dynamics (MD) simulations, we reveal that the SF in down-state undergoes inactivation via conformational changes, while the up-state structure maintains a stable and conductive SF. This suggests an atomistic mechanism for the low channel activity previously assigned to the down state, but not evident from the crystal structure. Furthermore, experimentally by using (de-)phosphorylation mimics and chemically attaching lipid tethers to the proximal C-terminus (pCt), we confirm the hypothesis that moving the pCt towards the membrane induces the up-state. Based on MD simulations, we propose two gating pathways by which movement of the pCt controls the stability (i.e., conductivity) of the filter gate. Together, these findings provide atomistic insights into the SF gating mechanism and the physiological regulation of TREK channels by phosphorylation.

The two-pore domain potassium (K2P) channels TREK-1 and TREK-2 link neuronal excitability to a variety of stimuli including mechanical force, lipids, temperature and phosphorylation. This regulation involves the C-terminus as a polymodal stimulus sensor and the selectivity filter (SF) as channel gate. Using crystallographic up- and down-state structures of TREK-2 as a template for full atomistic molecular dynamics simulations, we reveal that the SF in down-state undergoes inactivation via conformational changes at the S1 ion coordination site, while the up-state structure maintains a stable and conductive SF. This provides an atomistic understanding of the low channel activity previously assigned to the down state, but not evident from the crystal structure. Furthermore, by using (de-)phosphorylation mimics and chemically attaching lipid tethers to the proximal C-terminus (pCt), we confirm the hypothesis that moving the pCt towards the membrane induces the up-state. We also uncover two gating pathways by which movement of the pCt controls the stability (i.e. conductivity) of the filter gate. Together, these findings provide atomistic insights into the SF gating mechanism and the physiological regulation of TREK channels by phosphorylation.

Abstract Two-pore domain K + (K 2P ) channel activity was previously thought to be controlled primarily via a selectivity filter (SF) gate. However, recent crystal structures of TASK-1 and TASK-2 revealed a lower gate at the cytoplasmic pore entrance. Here, we report functional evidence of such a lower gate in the K 2P channel K2P17.1 (TALK-2, TASK-4). We identified compounds (drugs and lipids) and mutations that opened the lower gate allowing the fast modification of pore cysteine residues. Surprisingly, stimuli that exclusively target the SF gate (i.e., pH e ., Rb + permeation, membrane depolarization) also opened the cytoplasmic gate suggesting that the SF can induce global structural changes in TALK-2. Reciprocally, opening of the lower gate reduced the electrical work required to force ions into the SF to induce its opening as apparent in large shifts of the conductance-voltage (G-V) curves. These shifts, thereby, represent the mechanical work done by the SF to induce a global structural re-arrangement that opened the lower gate. In conclusion, it appears that the SF is so rigidly locked into the TALK-2 protein structure that changes in ion occupancy can pry open a distant lower gate. Vice versa, we show that opening of the lower gate concurrently forces the SF gate to open. This concept might extent to other K + channels that contain two gates (e.g., voltage-gated K + channels) for which such a positive gate coupling has been suggested, but so far not directly demonstrated. Synopsis TALK-2 channels, like most K 2P channels, possess a functional gate in the selectivity filter (SF; the upper gate) that is opened by rising extracellular pH and voltage-dependent ion binding (voltage gating). A second (lower) permeation gate in TALK-2 at the cytoplasmic end of TM4 is identified using cysteine modification, scanning mutagenesis and structural modelling. This gate can be opened by anionic lipids (LC-CoA) as well as pharmacological ligands (e.g., 2-APB). The modification reactivity of a cysteine introduced between the two gates reveal that stimuli targeting the SF gate also open the lower gate. Furthermore, stimuli that open the lower gate reduce the voltage (i.e., electrical work or mechanical load) required to open the SF gate. These findings demonstrate a tight positive coupling between the two gates. The concept of strong positive gate coupling might extend to other K + channels with two gates (e.g., voltage-gated K + channels) for which positive gate coupling has been suggested but so far not directly demonstrated.