Human intestinal organoids (HIOs) generated from pluripotent stem cells provide extraordinary opportunities to explore development and disease. Here, we generate a single-cell transcriptome reference atlas from HIOs and from multiple developing human organs to quantify the specificity of HIO cell fate acquisition, and to explore alternative fates. We identify epithelium-mesenchyme interactions, transcriptional regulators involved in cell fate specification, and stem cell maturation features in the primary tissue that are recapitulated in HIOs. We use an HIO time course to reconstruct the molecular dynamics of intestinal stem cell emergence, as well as the specification of multiple mesenchyme subtypes. We find that the intestinal master regulator CDX2 correlates with distinct phases of epithelial and mesenchymal development, and CDX2 deletion perturbs the differentiation of both intestinal epithelium and mesenchyme. Collectively our data provides a comprehensive and quantitative assessment of HIO development, and illuminates the molecular machinery underlying endodermal and mesodermal cell fate specification.

Methods to generate human intestinal tissue from pluripotent stem cells (PSCs) open new inroads into modeling intestine development and disease. However, current protocols require organoid transplantation into an immunocompromised mouse to achieve matured and differentiated epithelial cell states. Inspired by developmental reconstructions from primary tissues, we establish a regimen of inductive cues that enable stem cell maturation and epithelial differentiation entirely in vitro . We show that the niche factor Neuregulin1 (NRG1) promotes morphological change from proliferative epithelial cysts to matured epithelial tissue in three-dimensional cultures. Single-cell transcriptome analyses reveal differentiated epithelial cell populations, including diverse secretory and absorptive lineages. Comparison to multi-organ developmental and adult intestinal cell atlases confirm the specificity and maturation state of cell populations. Altogether, this work opens a new direction to use in vitro matured epithelium from human PSCs to study human intestinal epithelium development, disease, and evolution in controlled culture environments.

The intimate relationship between the epithelium and immune system is crucial for maintaining tissue homeostasis, with perturbations therein linked to autoimmune disease and cancer1–3. Whereas stem cell-derived organoids are powerful models of epithelial function4, they lack tissue-resident immune cells that are essential for capturing organ-level processes. We describe human intestinal immuno-organoids (IIOs), formed through self-organization of epithelial organoids and autologous tissue-resident memory T (TRM) cells, a portion of which integrate within the epithelium and continuously survey the barrier. TRM cell migration and interaction with epithelial cells was orchestrated by TRM cell-enriched transcriptomic programs governing cell motility and adhesion. We combined IIOs and single-cell transcriptomics to investigate intestinal inflammation triggered by cancer-targeting biologics in patients. Inflammation was associated with the emergence of an activated population of CD8+ T cells that progressively acquired intraepithelial and cytotoxic features. The appearance of this effector population was preceded and potentiated by a T helper-1-like CD4+ population, which initially produced cytokines and subsequently became cytotoxic itself. As a system amenable to direct perturbation, IIOs allowed us to identify the Rho pathway as a new target for mitigation of immunotherapy-associated intestinal inflammation. Given that they recapitulate both the phenotypic outcomes and underlying interlineage immune interactions, IIOs can be used to study tissue-resident immune responses in the context of tumorigenesis and infectious and autoimmune diseases. We combined human intestinal immuno-organoids and single-cell transcriptomics to investigate intestinal inflammation triggered by cancer-targeting biologics, which was associated with an activated population of CD8+ T cells that progressively acquired intraepithelial and cytotoxic features.

The intimate relationship between the epithelium and the immune system is crucial for maintaining tissue homeostasis, with perturbations in epithelial-immune interactions linked to autoimmune disease and cancer. Whereas stem cell-derived organoids are powerful models of tissue-specific epithelial function, these structures lack tissue-resident immune cells that are essential for capturing organ-level processes. We describe human intestinal immuno-organoids (IIOs), formed through self-organization of epithelial organoids and autologous tissueresident lymphocytes (TRMs), a portion of which integrate within the IIO epithelium and survey the barrier. IIO formation was driven by TRM migration and interaction with epithelial cells, as orchestrated by TRM- enriched transcriptomic programs governing cell motility and epithelial inspection. We combined IIOs and single-cell transcriptomics to investigate intestinal inflammation triggered by cancer-targeting biologics in patients, and found that the system recapitulates clinical outcomes and the underlying cellular mechanisms. Inflammation was associated with the emergence of an activated population of CD8+ T cells, which progressively acquired intraepithelial and cytotoxic features. The appearance of this effector population was preceded and likely mediated by a Th1- like CD4+ population, which initially displayed a cytokine producing character and subsequently became cytotoxic itself. A system amenable to direct perturbation and interrogation, IIOs allowed us to identify the Rho pathway as a novel target for mitigating immunotherapy-associated intestinal inflammation. Given that they recapitulate both the phenotypic outcomes and the underlying inter-lineage immune interactions, IIOs can be used to broadly study tissue-resident immune responses in the context of tumorigenesis, infectious and autoimmune diseases.

Human stem cells can generate complex, multicellular epithelial tissues of endodermal origin in vitro that recapitulate aspects of developing and adult human physiology. These tissues, also called organoids, can be derived from pluripotent stem cells or tissue-resident fetal and adult stem cells. However, it has remained difficult to understand the precision and accuracy of organoid cell states through comparison with primary counterparts, and to comprehensively assess the similarity and differences between organoid protocols. Advances in computational single-cell biology now allow the integration of datasets with high technical variability. Here, we integrate single-cell transcriptomes from 218 samples covering organoids of diverse endoderm-derived tissues including lung, pancreas, intestine, liver, biliary system, stomach, and prostate to establish an initial version of a human endoderm organoid cell atlas (HEOCA). The integration includes nearly one million cells across diverse conditions, data sources and protocols. We align and compare cell types and states between organoid models, and harmonize cell type annotations by mapping the atlas to primary tissue counterparts. To demonstrate utility of the atlas, we focus on intestine and lung, and clarify ontogenic cell states that can be modeled in vitro. We further provide examples of mapping novel data from new organoid protocols to expand the atlas, and showcase how integrating organoid models of disease into the HEOCA identifies altered cell proportions and states between healthy and disease conditions. The atlas makes diverse datasets centrally available, and will be valuable to assess organoid fidelity, characterize perturbed and diseased states, and streamline protocol development.