Abstract Drosophila embryogenesis begins with nuclear division in a common cytoplasm forming a syncytial cell. Morphogen gradient molecules spread across nucleo-cytoplasmic domains to pattern the body axis of the syncytial embryo. The diffusion of molecules across the syncytial nucleo-cytoplasmic domains is potentially constrained by association with the components of cellular architecture, however the extent of restriction has not been examined so far. Here we use photoactivation (PA) to generate a source of cytoplasmic or cytoskeletal molecules in order to monitor the kinetics of their spread in the syncytial Drosophila embryo. Photoactivated PA-GFP and PA-GFP-Tubulin within a fixed anterior area diffused along the antero-posterior axis. These molecules were enriched in cortical cytoplasm above the yolk-filled center suggesting that the cortical cytoplasm is phase separated from the yolk-filled center. The length scales of diffusion were extracted using exponential fits under steady state assumptions. PA-GFP spread to greater distance as compared to PA-GFP-Tubulin. Both gradients were steeper and more restricted when generated in the center of the embryo probably due to a higher density of nucleo-cytoplasmic domains. The length scale of diffusion for PA-GFP-Tubulin gradient increased in mutant embryos containing short plasma membrane furrows and disrupted tubulin cytoskeleton. The PA-GFP gradient shape was unaffected by cyto-architecture perturbation. Taken together, these data show that PA-GFP-Tubulin gradient is largely restricted by its incorporation in the microtubule network and intact plasma membrane furrows. This photoactivation based analysis of protein spread across allows for interpretation of the dependence of gradient formation on the syncytial cyto-architecture.

Metazoan development proceeds through a series of morphogenetic events that sculpt body plans and organ structures. In the early embryonic stages, morphogenetic processes involving growth and deformation occur concurrently. Forces generated in one tissue can thus increase mechanical stress in the neighboring tissue, potentially disrupting spatial patterning, morphological robustness, and consequently decreasing organismal fitness. How organisms evolved mechanisms to reduce or release inter-tissue stresses remains poorly understood. Here we combined phylogenetic survey across a whole insect order (Diptera), quantitative live imaging, and functional mechanical perturbation to investigate the evolution of mechanical stress management during epithelial expansions in the gastrulating fly embryos. We find that two distinct cellular mechanisms exist in Diptera to prevent the accumulation of compressive stress that can arise when the expanding head and trunk tissues collide. In Cyclorrhapha, a monophyletic dipteran subgroup including the fruit fly Drosophila melanogaster, the head-trunk boundary undergoes active out-of-plane deformation to form a transient epithelial fold, called the cephalic furrow (CF), which acts as a mechanical sink to preempt head-trunk collision. Genetic or optogenetic elimination of the CF leads to tissue buckling, yielding deleterious effects of axial distortion that likely results from unmitigated release of compressive stress. Non-cyclorrhaphan flies, by contrast, lack CF formation and instead display widespread out-of-plane division in the head, which shortens the duration of its expansion and reduces surface area increase. Reorienting head mitosis in Drosophila from in-plane to out-of-plane partially suppresses the need for epithelial out-of-plane deformation, suggesting that out-of-plane division can act as an alternative mechanical sink to prevent tissue collision. Our data suggest that programs of mechanical stress management can emerge abruptly under selective pressure of inter-tissue mechanical conflict in early embryonic development.

Abstract The initially homogeneous epithelium of the early Drosophila embryo differentiates into regional subpopulations with different behaviours and physical properties that are needed for morphogenesis. The factors at top of the genetic hierarchy that control these behaviours are known, but many of their targets are not. To understand how proteins work together to mediate differential cellular activities, we studied in an unbiased manner the proteomes and phosphoproteomes of the three main cell populations along the dorso-ventral axis during gastrulation using mutant embryos that represent the different populations. We detected 6111 protein groups and 6259 phosphosites of which 3399 and 3433 respectively, were differentially regulated. The changes in phosphosite abundance did not correlate with changes in host protein abundance, showing phosphorylation to be a regulatory step during gastrulation. Hierarchical clustering of protein groups and phosphosites identified clusters that contain known fate determinants such as Doc1, Sog, Snail and Twist. The recovery of the appropriate known marker proteins in each of the different mutants we used validated the approach, but also revealed that two mutations that both interfere with the dorsal fate pathway, Toll 10B and serpin27a ex do this in very different manners. Diffused network analyses within each cluster point to microtubule components as one of the main groups of regulated proteins. Functional studies on the role of microtubules provide the proof of principle that microtubules have different functions in different domains along the DV axis of the embryo.

Epithelial cells have a polarised distribution of protein complexes on the lateral membrane and are present as a polygonal array dominated by hexagons. Metazoan embryogenesis enables the study of temporal formation of the polygonal array and mechanisms that regulate its distribution. The plasma membrane of the syncytial Drosophila blastoderm embryo is organized as a polygonal array during cortical division cycles with an apical membrane and lateral furrow in between adjacent nuclei. We find that polygonal plasma membrane organization arises in syncytial division cycle 11 and hexagon dominance occurs with increase in furrow length in cycle 12. This is coincident with DE-cadherin and Bazooka enrichment at edges and the septin, Peanut enrichment at vertices of the base of the furrow. DE-cadherin depletion leads to loss of hexagon dominance. Bazooka and Peanut depletion leads to a delay in occurrence of hexagon dominance from nuclear cycle 12 to 13. Hexagon dominance in Bazooka and Peanut mutants occurs with furrow extension and correlates with increase in DE-cadherin in syncytial cycle 13. We conclude that a change in polarity complex distribution leads to loss of furrow stability thereby changing the polygonal organization of the blastoderm embryo.