The discovery of air-stable n-dopants for organic semiconductor materials has been hindered by the necessity of high-energy HOMOs and the air sensitivity of compounds that satisfy this requirement. One strategy for circumventing this problem is to utilize stable precursor molecules that form the active doping complex in situ during the doping process or in a postdeposition thermal- or photo-activation step. Some of us have reported on the use of 1H-benzimidazole (DMBI) and benzimidazolium (DMBI-I) salts as solution- and vacuum-processable n-type dopant precursors, respectively. It was initially suggested that DMBI dopants function as single-electron radical donors wherein the active doping species, the imidazoline radical, is generated in a postdeposition thermal annealing step. Herein we report the results of extensive mechanistic studies on DMBI-doped fullerenes, the results of which suggest a more complicated doping mechanism is operative. Specifically, a reaction between the dopant and host that begins with either hydride or hydrogen atom transfer and which ultimately leads to the formation of host radical anions is responsible for the doping effect. The results of this research will be useful for identifying applications of current organic n-doping technology and will drive the design of next-generation n-type dopants that are air stable and capable of doping low-electron-affinity host materials in organic devices.

Abstract With the recent explosion in high-resolution protein structures, one of the next frontiers in biology is elucidating the mechanisms by which conformational rearrangements in proteins are regulated to meet the needs of cells under changing conditions. Rigorously measuring protein energetics and dynamics requires the development of new methods that can resolve structural heterogeneity and conformational distributions. We have previously developed steady-state transition metal ion fluorescence resonance energy transfer (tmFRET) approaches using a fluorescent noncanonical amino acid donor (Anap) and transition metal ion acceptor, to probe conformational rearrangements in soluble and membrane proteins. Here, we show that the fluorescent noncanonical amino acid Acd has superior photophysical properties that extend its utility as a donor for tmFRET. Using maltose binding protein (MBP) expressed in mammalian cells as a model system, we show that Acd is comparable to Anap in steady-state tmFRET experiments and that its long, single-exponential lifetime is better suited for probing conformational distributions using time-resolved FRET. These experiments reveal differences in heterogeneity in the apo and holo conformational states of MBP and produce accurate quantification of the distributions among apo and holo conformational states at subsaturating maltose concentrations. Our new approach using Acd for time-resolved tmFRET sets the stage for measuring the energetics of conformational rearrangements in soluble and membrane proteins in near-native conditions.

With the great progress on determining protein structures over the last decade comes a renewed appreciation that structures must be combined with dynamics and energetics to understand function. Fluorescence spectroscopy, specifically Förster resonance energy transfer (FRET) provides a great window into dynamics and energetics due to its application at physiological temperatures and ability to measure dynamics on the ångström scale. We have recently advanced transition metal FRET (tmFRET) to study allosteric regulation of maltose binding protein and have reported measurements of maltose-dependent distance changes with an accuracy of ~1.5 Å. When paired with the noncanonical amino acid Acd as a donor, our previous tmFRET acceptors were useful over a working distance of 10 Å to 20 Å. Here, we use cysteine-reactive bipyridyl and phenanthroline compounds as chelators for novel Fe2+- and Ru2+-based tmFRET acceptors to expand the working distance to as long as 50 Å, while preserving our ability to resolve even small maltose-dependent changes in distance. We compare our measured FRET efficiencies to predictions based on models using rotameric ensembles of the donors and acceptors to demonstrate that steady-state measurements of tmFRET with our new probes have unprecedented ability to measure conformational rearrangements under physiological conditions.

Proteins are the workhorses of biology, orchestrating a myriad of cellular functions through intricate conformational changes. Protein allostery, the phenomenon where binding of ligands or environmental changes induce conformational rearrangements in the protein, is fundamental to these processes. We have previously shown that transition metal Förster resonance energy transfer (tmFRET) can be used to interrogate the conformational rearrangements associated with protein allostery and have recently introduced novel FRET acceptors utilizing metal-bipyridyl derivatives to measure long (>20 Å) intramolecular distances in proteins. Here, we combine our tmFRET system with fluorescence lifetime measurements to measure the distances, conformational heterogeneity, and energetics of maltose binding protein (MBP), a model allosteric protein. Time-resolved tmFRET captures near-instantaneous snapshots of distance distributions, offering insights into protein dynamics. We show that time-resolved tmFRET can accurately determine distance distributions and conformational heterogeneity of proteins. Our results demonstrate the sensitivity of time-resolved tmFRET in detecting subtle conformational or energetic changes in protein conformations, which are crucial for understanding allostery. In addition, we extend the use of metal-bipyridyl compounds, showing Cu(phen)2+ can serve as a spin label for pulse dipolar electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, a method which also reveals distance distributions and conformational heterogeneity. The EPR studies both establish Cu(phen)2+ as a useful spin label for pulse dipolar EPR and validate our time-resolved tmFRET measurements. Our approach offers a versatile tool for deciphering conformational landscapes and understanding the regulatory mechanisms governing biological processes.