Abstract Here we introduce chiLife, a Python package for site-directed spin label (SDSL) modeling for electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, in particular double electron–electron resonance (DEER). It is based on in silico attachment of rotamer ensemble representations of spin labels to protein structures. chiLife enables the development of custom protein analysis and modeling pipelines using SDSL EPR experimental data. It allows the user to add custom spin labels, scoring functions and spin label modeling methods. chiLife is designed with integration into third-party software in mind, to take advantage of the diverse and rapidly expanding set of molecular modeling tools available with a Python interface. This article describes the main design principles of chiLife and presents a series of examples. Author summary Thanks to modern modeling methods like AlphaFold2, RosettaFold, and ESMFold, high-resolution structural models of proteins are widely available. While these models offer insight into the structure and function of biomedically and technologically significant proteins, most of them are not experimentally validated. Furthermore, many proteins exhibit functionally important conformational flexibility that is not captured by these models. Site-directed spin labeling (SDSL) electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is a powerful tool for probing protein structure and conformational heterogeneity, making it ideal for validating, refining, and expanding protein models. To extract quantitative protein backbone information from experimental SDSL EPR data, accurate modeling methods are needed. For this purpose, we introduce chiLife, an open-source Python package for SDSL modeling designed to be extensible and integrable with other Python-based protein modeling packages. With chiLife, appropriate SDSL EPR experiments for protein model validation can be designed, and protein models can be refined using experimental SDSL EPR data as constraints.

Despite advances in sampling and scoring strategies, Monte Carlo modeling methods still struggle to accurately predict de novo the structures of large proteins, membrane proteins, or proteins of complex topologies. Previous approaches have addressed these shortcomings by leveraging sparse distance data gathered using site-directed spin labeling and electron paramagnetic resonance spectroscopy (SDSL-EPR) to improve protein structure prediction and refinement outcomes. However, existing computational implementations must choose between coarse-grained models of the spin label that lower the resolution and explicit models that lead to resource-intense simulations. Existing methods are further limited by their reliance on distance distributions, which are calculated from a primary refocused echo decay signal and may contain artifacts introduced during this processing step. Here, we addressed these challenges by developing RosettaDEER, a scoring method within the Rosetta software suite capable of simulating distance distributions and echo decay traces between spin labels fast enough to fold proteins de novo. We demonstrate that the accuracy of resulting distance distributions match or exceed those generated by more computationally intensive methods. Moreover, decay traces generated from these distributions recapitulate intermolecular background coupling parameters, allowing RosettaDEER to discriminate between poorly-folded and native-like models even when the time window of EPR data collection is truncated, rendering them unsuitable for accurate transformation into distance distributions. Finally, we demonstrate that one decay trace per nine residues is sufficient to predict the folds of Bax and the C-terminus of ExoU, two soluble proteins with surface-exposed amphipathic structural features that prevent the Rosetta energy function from correctly identifying native-like models in the absence of experimental data. These benchmarking results confirm that RosettaDEER can effectively leverage sparse experimental data for a wide array of modeling applications built into the Rosetta software suite.

With the great progress on determining protein structures over the last decade comes a renewed appreciation that structures must be combined with dynamics and energetics to understand function. Fluorescence spectroscopy, specifically Förster resonance energy transfer (FRET) provides a great window into dynamics and energetics due to its application at physiological temperatures and ability to measure dynamics on the ångström scale. We have recently advanced transition metal FRET (tmFRET) to study allosteric regulation of maltose binding protein and have reported measurements of maltose-dependent distance changes with an accuracy of ~1.5 Å. When paired with the noncanonical amino acid Acd as a donor, our previous tmFRET acceptors were useful over a working distance of 10 Å to 20 Å. Here, we use cysteine-reactive bipyridyl and phenanthroline compounds as chelators for novel Fe2+- and Ru2+-based tmFRET acceptors to expand the working distance to as long as 50 Å, while preserving our ability to resolve even small maltose-dependent changes in distance. We compare our measured FRET efficiencies to predictions based on models using rotameric ensembles of the donors and acceptors to demonstrate that steady-state measurements of tmFRET with our new probes have unprecedented ability to measure conformational rearrangements under physiological conditions.

Proteins are the workhorses of biology, orchestrating a myriad of cellular functions through intricate conformational changes. Protein allostery, the phenomenon where binding of ligands or environmental changes induce conformational rearrangements in the protein, is fundamental to these processes. We have previously shown that transition metal Förster resonance energy transfer (tmFRET) can be used to interrogate the conformational rearrangements associated with protein allostery and have recently introduced novel FRET acceptors utilizing metal-bipyridyl derivatives to measure long (>20 Å) intramolecular distances in proteins. Here, we combine our tmFRET system with fluorescence lifetime measurements to measure the distances, conformational heterogeneity, and energetics of maltose binding protein (MBP), a model allosteric protein. Time-resolved tmFRET captures near-instantaneous snapshots of distance distributions, offering insights into protein dynamics. We show that time-resolved tmFRET can accurately determine distance distributions and conformational heterogeneity of proteins. Our results demonstrate the sensitivity of time-resolved tmFRET in detecting subtle conformational or energetic changes in protein conformations, which are crucial for understanding allostery. In addition, we extend the use of metal-bipyridyl compounds, showing Cu(phen)2+ can serve as a spin label for pulse dipolar electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, a method which also reveals distance distributions and conformational heterogeneity. The EPR studies both establish Cu(phen)2+ as a useful spin label for pulse dipolar EPR and validate our time-resolved tmFRET measurements. Our approach offers a versatile tool for deciphering conformational landscapes and understanding the regulatory mechanisms governing biological processes.

We introduce a novel approach to modeling side chain ensembles of bifunctional spin labels. This approach utilizes rotamer libraries to generate side chain conformational ensembles. Because the bifunctional label is constrained by two attachment sites, the label is split into two monofunctional rotamers which are first attached to their respective sites, then rejoined by a local optimization in dihedral space. We validate this method against a set of previously published experimental data using the bifunctional spin label, RX. This method is relatively fast and can readily be used for both experimental analysis and protein modeling, providing significant advantages over modeling bifunctional labels with molecular dynamics simulations. Use of bifunctional labels for site directed spin labeling (SDSL) electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy dramatically reduces label mobility, which can significantly improve resolution of small changes in protein backbone structure and dynamics. Coupling the use of bifunctional labels with side chain modeling methods allows for improved quantitative application of experimental SDSL EPR data to protein modeling.