The applications of extracellular vesicles (EVs) as therapeutics or nanocarriers for cell-free therapies necessitates a comprehensive assessment of their bioactivity, batch-to-batch reproducibility, and stability. Due to the considerable heterogeneity in EV preparations, there is a crucial need for a sensitive functional test to complement established methods for EV characterization. In this study, we introduce the detectEVs assay, an enzymatic-based approach designed to evaluate EV bioactivity. Specifically, this assay enables quantitative measurement of both EV bioactivity and integrity in small-size EV samples through a single-step analysis. Moreover, the detectEV assay proves effective for quality checking EVs post-isolation, during storage, and loading processes. The development and validation of this robust and straightforward test were extended to EVs from different cell lines and hold promise for enhancing the characterization of EVs, thereby enabling the prediction of their potency.

Due to their intercellular communication properties and their involvement in a wide range of biological processes, extracellular vesicles (EVs) are increasingly being studied and exploited for different applications. Nevertheless, their complex nature and heterogeneity, as well as the challenges related to their isolation, purification and characterization procedures, require cautious assessment of the quality and quantity parameters to monitor. This translates into a multitude of choices and putative solutions that lie in front of any EV researcher, in both research and translational environments, resembling a labyrinth with multiple paths to cross and, possibly, more than one exit. In this respect, decision-making tools might represent our modern Ariadne9s string to follow not to get lost or distracted along the journey, to choose the shorter and best-fit-to-source EV application(s) and vice versa. Here, we present the implementation of a multi-criteria EV decision-making grid (EV-DMG) as a novel, customizable, efficient and easy-to-use tool to support responsible EV research and innovation. By identifying and weighting key assessment criteria for comparing distinct EV-based preparations and/or processes, our EV-DMG may assist any EV community member in making informed, transparent and reproducible decisions regarding the EV sources and/or samples to be managed, as well as the most suitable production and/or analytical pipelines to be adopted for targeting a defined aim or application.

ABSTRACT Nanoalgosomes are extracellular vesicles (EVs) released by microalgal cells that can mediate intercellular and cross-kingdom communication. In the present study, starting from the optimized nanoalgosome manufacturing from cultures of marine microalgae, we evaluated their innate biological properties in preclinical models. Our investigation of nanoalgosome biocompatibility included toxicological analyses, starting from studies on the invertebrate model organism Caenorhabditis elegans, proceeding to hematological and immunological evaluations in mice and immune-compatibility ex vivo . Nanoalgosome biodistribution was evaluated in mice with accurate space-time resolution, and in C. elegans at cellular and subcellular levels. Further examination highlighted the antioxidant and anti-inflammatory bioactivities of nanoalgosomes. This holistic approach to nanoalgosome functional characterization showcases that nanoalgosomes are innate effectors and potential drug delivery system for novel cosmetic formulations and EV-based therapies.

Abstract The application of extracellular vesicles (EVs) as therapeutics or nanocarriers in cell‐free therapies necessitates meticulous evaluations of different features, including their identity, bioactivity, batch‐to‐batch reproducibility, and stability. Given the inherent heterogeneity in EV preparations, this assessment demands sensitive functional assays to provide key quality control metrics, complementing established methods to ensure that EV preparations meet the required functionality and quality standards. Here, we introduce the detectEV assay, an enzymatic‐based approach for assessing EV luminal cargo bioactivity and membrane integrity. This method is fast, cost‐effective, and quantifiable through enzymatic units. Utilizing microalgae‐derived EVs, known as nanoalgosomes, as model systems, we optimised the assay parameters and validated its sensitivity and specificity in quantifying the enzymatic activity of esterases within the EV lumen while also evaluating EV membrane integrity. Compared to conventional methods that assess physicochemical features of EVs, our single‐step analysis efficiently detects batch‐to‐batch variations by evaluating changes in luminal cargo bioactivity and integrity across various EV samples, including differences under distinct storage conditions and following diverse isolation and exogenous loading methods, all using small sample sizes. The detectEV assay's application to various human‐derived EV types demonstrated its versatility and potential universality. Additionally, the assay effectively predicted EV functionality, such as the antioxidant activity of different nanoalgosome batches. Our findings underscore the detectEV assay's utility in comprehensive characterization of EV functionality and integrity, enhancing batch‐to‐batch reproducibility and facilitating their therapeutic applications.