CD90+ liver cancer cells have been described as cancer stem-cell-like (CSC), displaying aggressive and metastatic phenotype. Using two different in vitro models, already described as CD90+ liver cancer stem cells, our aim was to study their interaction with endothelial cells mediated by the release of exosomes. Exosomes were isolated and characterized from both liver CD90+ cells and hepatoma cell lines. Endothelial cells were treated with exosomes, as well as transfected with a plasmid containing the full length sequence of the long non-coding RNA (lncRNA) H19. Molecular and functional analyses were done to characterize the endothelial phenotype after treatments. Exosomes released by CD90+ cancer cells, but not by parental hepatoma cells, modulated endothelial cells, promoting angiogenic phenotype and cell-to-cell adhesion. LncRNA profiling revealed that CD90+ cells were enriched in lncRNA H19, and released this through exosomes. Experiments of gain and loss of function of H19 showed that this LncRNA plays an important role in the exosome-mediated phenotype of endothelial cells. Our data indicate a new exosome-mediated mechanism by which CSC-like CD90+ cells could influence their tumor microenvironment by promoting angiogenesis. Moreover, we suggest the lncRNA H19 as a putative therapeutic target in hepatocellular carcinoma.

// Stefania Raimondo 1 , Flores Naselli 1 , Simona Fontana 1 , Francesca Monteleone 1 , Alessia Lo Dico 1 , Laura Saieva 1 , Giovanni Zito 2 , Anna Flugy 1 , Mauro Manno 3 , Maria Antonietta Di Bella 1 , Giacomo De Leo 1 , Riccardo Alessandro 1 1 Dipartimento di Biopatologia e Biotecnologie Mediche, Università degli Studi di Palermo, sezione di Biologia e Genetica, Palermo, Italy 2 Laboratorio di Ingegneria Tissutale – Piattaforme Innovative per l’Ingegneria Tissutale (PON01–00829), Istituto Ortopedico Rizzoli, Palermo, Italy 3 Istituto di Biofisica, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Palermo, Italy Correspondence to: Riccardo Alessandro, e-mail: riccardo.alessandro@unipa.it Keywords: cancer, exosome-like nanovesicles, Citrus limon L., TRAIL-mediated cell death Received: April 03, 2015      Accepted: May 08, 2015      Published: May 18, 2015 ABSTRACT Nanosized vesicles are considered key players in cell to cell communication, thus influencing physiological and pathological processes, including cancer. Nanovesicles have also been found in edible-plants and have shown therapeutic activity in inflammatory bowel diseases; however information on their role in affecting cancer progression is missing. Our study identify for the first time a fraction of vesicles from lemon juice ( Citrus limon L.), obtained as a result of different ultracentrifugation, with density ranging from 1,15 to 1,19 g/ml and specific proteomic profile. By using an in vitro approach, we show that isolated nanovesicles inhibit cancer cell proliferation in different tumor cell lines, by activating a TRAIL-mediated apoptotic cell death. Furthermore, we demonstrate that lemon nanovesicles suppress CML tumor growth in vivo by specifically reaching tumor site and by activating TRAIL-mediated apoptotic cell processes. Overall, this study suggests the possible use of plant-edible nanovesicles as a feasible approach in cancer treatment.

Despite Imatinib (IM), a selective inhibitor of Bcr-Abl, having led to improved prognosis in Chronic Myeloid Leukemia (CML) patients, acquired resistance and long-term adverse effects is still being encountered.There is, therefore, urgent need to develop alternative strategies to overcome drug resistance.According to the molecules expressed on their surface, exosomes can target specific cells.Exosomes can also be loaded with a variety of molecules, thereby acting as a vehicle for the delivery of therapeutic agents.In this study, we engineered HEK293T cells to express the exosomal protein Lamp2b, fused to a fragment of Interleukin 3 (IL3).The IL3 receptor (IL3-R) is overexpressed in CML blasts compared to normal hematopoietic cells and thus is able to act as a receptor target in a cancer drug delivery system.Here we show that IL3L exosomes, loaded with Imatinib or with BCR-ABL siRNA, are able to target CML cells and inhibit in vitro and in vivo cancer cell growth.

The applications of extracellular vesicles (EVs) as therapeutics or nanocarriers for cell-free therapies necessitates a comprehensive assessment of their bioactivity, batch-to-batch reproducibility, and stability. Due to the considerable heterogeneity in EV preparations, there is a crucial need for a sensitive functional test to complement established methods for EV characterization. In this study, we introduce the detectEVs assay, an enzymatic-based approach designed to evaluate EV bioactivity. Specifically, this assay enables quantitative measurement of both EV bioactivity and integrity in small-size EV samples through a single-step analysis. Moreover, the detectEV assay proves effective for quality checking EVs post-isolation, during storage, and loading processes. The development and validation of this robust and straightforward test were extended to EVs from different cell lines and hold promise for enhancing the characterization of EVs, thereby enabling the prediction of their potency.

Abstract The application of extracellular vesicles (EVs) as therapeutics or nanocarriers in cell‐free therapies necessitates meticulous evaluations of different features, including their identity, bioactivity, batch‐to‐batch reproducibility, and stability. Given the inherent heterogeneity in EV preparations, this assessment demands sensitive functional assays to provide key quality control metrics, complementing established methods to ensure that EV preparations meet the required functionality and quality standards. Here, we introduce the detectEV assay, an enzymatic‐based approach for assessing EV luminal cargo bioactivity and membrane integrity. This method is fast, cost‐effective, and quantifiable through enzymatic units. Utilizing microalgae‐derived EVs, known as nanoalgosomes, as model systems, we optimised the assay parameters and validated its sensitivity and specificity in quantifying the enzymatic activity of esterases within the EV lumen while also evaluating EV membrane integrity. Compared to conventional methods that assess physicochemical features of EVs, our single‐step analysis efficiently detects batch‐to‐batch variations by evaluating changes in luminal cargo bioactivity and integrity across various EV samples, including differences under distinct storage conditions and following diverse isolation and exogenous loading methods, all using small sample sizes. The detectEV assay's application to various human‐derived EV types demonstrated its versatility and potential universality. Additionally, the assay effectively predicted EV functionality, such as the antioxidant activity of different nanoalgosome batches. Our findings underscore the detectEV assay's utility in comprehensive characterization of EV functionality and integrity, enhancing batch‐to‐batch reproducibility and facilitating their therapeutic applications.

Extracellular vesicle (EV) monitoring can complement clinical assessment of cancer response. In this study, patients with advanced non‐small cell lung cancer (NSCLC) undergoing osimertinib, alectinib, pembrolizumab or platinum‐based chemotherapy ± pembrolizumab were enrolled. EVs were characterized using Bradford assay to quantify the circulating cell‐free EV protein content (cfEV), and dynamic light scattering to assess Rayleigh ratio excess at 90°, z‐averaged hydrodynamic diameter and polydispersity index. A total of 135 plasma samples from 27 patients were collected at baseline (T0) and at the first radiological restaging (T1). A ∆cfEV < 20% was associated with improved median progression‐free survival (mPFS) in responders versus non‐responders. Specifically, cfEV responders on pembrolizumab had a significantly better mPFS (25.2 months) compared to those on chemotherapy plus pembrolizumab (6.1 months). EGFR ‐positive cfEV responders also experienced longer mPFS compared to cfEV non‐responders (35.1 months, 95% CI: 14.9–35.5 vs. 20.8 months, 95% CI: 11.2–30.4). This study suggested that monitoring circulating EV could provide valuable insights into treatment efficacy in NSCLC, particularly for patients receiving pembrolizumab or osimertinib.

Due to their intercellular communication properties and their involvement in a wide range of biological processes, extracellular vesicles (EVs) are increasingly being studied and exploited for different applications. Nevertheless, their complex nature and heterogeneity, as well as the challenges related to their isolation, purification and characterization procedures, require cautious assessment of the quality and quantity parameters to monitor. This translates into a multitude of choices and putative solutions that lie in front of any EV researcher, in both research and translational environments, resembling a labyrinth with multiple paths to cross and, possibly, more than one exit. In this respect, decision-making tools might represent our modern Ariadne9s string to follow not to get lost or distracted along the journey, to choose the shorter and best-fit-to-source EV application(s) and vice versa. Here, we present the implementation of a multi-criteria EV decision-making grid (EV-DMG) as a novel, customizable, efficient and easy-to-use tool to support responsible EV research and innovation. By identifying and weighting key assessment criteria for comparing distinct EV-based preparations and/or processes, our EV-DMG may assist any EV community member in making informed, transparent and reproducible decisions regarding the EV sources and/or samples to be managed, as well as the most suitable production and/or analytical pipelines to be adopted for targeting a defined aim or application.

ABSTRACT Nanoalgosomes are extracellular vesicles (EVs) released by microalgal cells that can mediate intercellular and cross-kingdom communication. In the present study, starting from the optimized nanoalgosome manufacturing from cultures of marine microalgae, we evaluated their innate biological properties in preclinical models. Our investigation of nanoalgosome biocompatibility included toxicological analyses, starting from studies on the invertebrate model organism Caenorhabditis elegans, proceeding to hematological and immunological evaluations in mice and immune-compatibility ex vivo . Nanoalgosome biodistribution was evaluated in mice with accurate space-time resolution, and in C. elegans at cellular and subcellular levels. Further examination highlighted the antioxidant and anti-inflammatory bioactivities of nanoalgosomes. This holistic approach to nanoalgosome functional characterization showcases that nanoalgosomes are innate effectors and potential drug delivery system for novel cosmetic formulations and EV-based therapies.

Background: The incidence of various types of cancer, for example, papillary thyroid carcinoma (PTC), is on the rise. Since therapeutic success depends greatly on early diagnosis, reliable diagnostic biomarkers must be identified, and easy-to-apply tools for detecting them must urgently be standardized. Here, we contribute to solving this medical challenge by assessing miRNAs suspected of promoting carcinogenesis in extracellular vesicles (EVs) that can be routinely obtained via liquid biopsy. We profit from current progress in cancerology that provides innovations in liquid biopsy and EVs analysis, along with the identification of miRNAs and chaperone system (CS) components implicated in carcinogenesis. Methods: We measured in EVs obtained from circulating blood plasma from PTC patients the levels of three miRNAs implicated in thyroid cancer, hsa-miR-1-3p, hsa-miR-206, and hsa-miR-221-3p, and most likely involved in the regulation of two members of the CS, Hsp60 and CCT. EVs were isolated from the plasma of patients with PTC and controls with benign goiter (BG) and from the culture medium of a PTC cell line (MDAT32) and were appropriately characterized. Results: The levels of miRNAs determined by RT-qPCR were consistently higher in PTC patients and decreased down to control levels after thyroidectomy. Bioinformatics showed that the miRNAs target genes are associated with the molecular pathogenesis of PTC. Conclusions: Our exploratory study reaffirms the potential in clinics of the selected miRNAs in EVs as useful biomarkers of PTC easily accessible via liquid biopsy, which is minimally invasive and amenable to periodic repetition, an improvement compared to the established fine-needle aspirate biopsy.