Abstract The functional diversity of natural killer (NK) cell repertoires stems from differentiation, homeostatic, receptor–ligand interactions and adaptive-like responses to viral infections. In the present study, we generated a single-cell transcriptional reference map of healthy human blood- and tissue-derived NK cells, with temporal resolution and fate-specific expression of gene-regulatory networks defining NK cell differentiation. Transfer learning facilitated incorporation of tumor-infiltrating NK cell transcriptomes (39 datasets, 7 solid tumors, 427 patients) into the reference map to analyze tumor microenvironment (TME)-induced perturbations. Of the six functionally distinct NK cell states identified, a dysfunctional stressed CD56 bright state susceptible to TME-induced immunosuppression and a cytotoxic TME-resistant effector CD56 dim state were commonly enriched across tumor types, the ratio of which was predictive of patient outcome in malignant melanoma and osteosarcoma. This resource may inform the design of new NK cell therapies and can be extended through transfer learning to interrogate new datasets from experimental perturbations or disease conditions.

Abstract Natural killer (NK) cells are innate lymphoid cells (ILCs) contributing to immune responses to microbes and tumors. Historically, their classification hinged on a limited array of surface protein markers. Here, we used single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing (CITE-seq) to dissect the heterogeneity of NK cells. We identified three prominent NK cell subsets in healthy human blood: NK1, NK2 and NK3, further differentiated into six distinct subgroups. Our findings delineate the molecular characteristics, key transcription factors, biological functions, metabolic traits and cytokine responses of each subgroup. These data also suggest two separate ontogenetic origins for NK cells, leading to divergent transcriptional trajectories. Furthermore, we analyzed the distribution of NK cell subsets in the lung, tonsils and intraepithelial lymphocytes isolated from healthy individuals and in 22 tumor types. This standardized terminology aims at fostering clarity and consistency in future research, thereby improving cross-study comparisons.

Abstract Adaptive immunity and tumor-promoting inflammation exist in delicate balance in individual tumor microenvironments; however, the role of this balance in defining sensitivity and resistance to PD-1/PD-L1 blockade therapy in urothelial cancer and other malignancies is poorly understood. We pursued an unbiased systems biology approach using bulk RNA sequencing data to examine pre-treatment molecular features associated with sensitivity to PD-1/PD-L1 blockade in patients with metastatic urothelial cancer and identified an adaptive_immune_response module associated with response and an inflammatory_response module and stromal module associated with resistance. We mapped these gene modules onto single-cell RNA sequencing data demonstrating the adaptive_immune_response module emanated predominantly from T, NK, and B cells, the inflammatory_response module from monocytes/macrophages, and the stromal module from fibroblasts. The adaptive_immune_response:inflammatory_response module expression ratio in individual tumors, reflecting the balance between antitumor immunity and tumor-associated inflammation and coined the 2IR score, best correlated with clinical outcomes and was validated in an independent cohort. Individual monocytes/macrophages with low 2IR scores demonstrated upregulation of proinflammatory genes including IL1B and downregulation of antigen presentation genes, were unrelated to classical M1 versus M2 polarization, and were enriched in pre-treatment peripheral blood from patients with PD-L1 blockade-resistant metastatic urothelial cancer. Single sentence summary Proinflammatory monocytes/macrophages, present in tumor and blood, are associated with resistance to immune checkpoint blockade in urothelial cancer.

Abstract Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG), the first-line treatment for non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC), promotes the production of inflammatory cytokines, particularly interferon (IFN)-γ. Prolonged inflammation and IFN-γ exposure are known to cause an adaptive immune response, enabling immune escape and proliferation by tumor cells. We investigated HLA-E and NKG2A, a novel T and NK cell checkpoint pathway, as a driver of adaptive resistance in BCG unresponsive NMIBC. We observed ubiquitous inflammation in all patients after BCG immunotherapy, regardless of recurrence status. IFN-γ was shown to drive tumor expression of HLA-E and PD-L1. Further, NKG2A-expressing NK and CD8 T cells were enriched in BCG unresponsive tumors and with enhanced capacity for cytolytic functions. Strikingly, in situ spatial analyses revealed that HLA-E HIGH tumors are activated to recruit NK and T cells via chemokine production, potentially sparing HLA-E LOW tumors that would otherwise be susceptible to lysis. Finally, blood-derived NK cells retained anti-tumor functions at the time of tumor recurrence. These data support combined NKG2A and PD-L1 blockade for BCG unresponsive disease.

Abstract The functional diversity of natural killer (NK) cell repertoires stems from differentiation, homeostatic receptor-ligand interactions, and adaptive-like responses to viral infections. Here, we generated a single-cell transcriptional reference map of healthy human blood and tissue-derived NK cells, with temporal resolution and fate-specific expression of gene regulator networks defining NK cell differentiation. Using transfer learning, transcriptomes of tumor-infiltrating NK cells from seven solid tumor types (427 patients), combined from 39 datasets, were incorporated into the reference map and interrogated for tumor microenvironment (TME)-induced perturbations. We identified six functionally distinct NK cellular states in healthy and malignant tissues, two of which were commonly enriched for across tumor types: a dysfunctional ‘stressed’ CD56 bright state susceptible to TME-induced immunosuppression and a cytotoxic TME-resistant ‘effector’ CD56 dim state. The ratio of ‘stressed’ CD56 bright and ‘effector’ CD56 dim was predictive of patient outcome in malignant melanoma and osteosarcoma. This resource may inform the design of novel NK cell therapies and can be extended endlessly through transfer learning to interrogate new datasets from experimental perturbations or disease conditions.

Human immunogenetic variation in the form of HLA and KIR types has been shown to be strongly associated with a multitude of immune-related phenotypes. We present MiDAS, an R package enabling statistical association analysis and using immunogenetic data transformation functions for HLA amino acid fine mapping, analysis of HLA evolutionary divergence as well as HLA-KIR interactions. MiDAS closes the gap between inference of immunogenetic variation and its efficient utilization to make meaningful discoveries.

Summary PD-1/PD-L1-blockade immunotherapies have limited efficacy in the treatment of muscle-invasive bladder cancer (MIBC) and metastatic urothelial carcinoma. Here, we show that KLRC1 (NKG2A) expression associates with improved survival and responsiveness to PD-L1 blockade immunotherapy in CD8A high bladder tumors. The loss of antigen presentation is a common mechanism for tumor escape in bladder cancer. NKG2A + CD8 T cells are able to circumvent HLA-ABC loss through TCR-independent cytotoxicity, which is partly mediated by DNAM-1. In bladder tumors, NKG2A is acquired on a subset of PD-1 + CD8 T cells, alongside stronger tissue-residency memory features, TCR-independent cytotoxicity and evidence of recent proliferation. HLA-E is low but variably expressed on bladder tumors. When expressed, NKG2A + CD8 T cell anti-tumor responses to HLA-ABC-deficient tumors are inhibited and partly restored upon NKG2A blockade. Overall, our study identifies an alternative path for CD8 T cell exhaustion, that is mediated by NKG2A upregulation and TCR-independent cytotoxicity.

Human Natural Killer (NK) cells are heterogeneous lymphocytes regulated by variegated arrays of germline-encoded activating and inhibitory receptors. They acquire the ability to detect polymorphic self-antigen via NKG2A/HLA-E or KIR/HLA-I ligand interactions through an education process. Correlations among HLA/KIR genes, kidney transplantation pathology and outcomes suggest that NK cells participate in allograft injury, but mechanisms linking NK HLA/KIR education to antibody-independent pathological functions remain unclear. We used CyTOF to characterize pre- and post-transplant peripheral blood NK cell phenotypes/functions before and after stimulation with allogeneic donor cells. Unsupervised clustering identified unique NK cell subpopulations present in varying proportions across patients, each of which responded heterogeneously to donor cells based on donor ligand expression patterns. Analyses of pre-transplant blood showed that educated, NKG2A/KIR-expressing NK cells responded greater than non-educated subsets to donor stimulators, and this heightened alloreactivity persisted > 6 months post-transplant despite immunosuppression. In distinct test and validation sets of patients participating in two clinical trials, pre-transplant donor-induced release of NK cell Ksp37, a cytotoxicity mediator, correlated with 2-year and 5-year eGFR. The findings explain previously reported associations between NK cell genotypes and transplant outcomes and suggest that pre-transplant NK cell analysis could function as a risk-assessment biomarker for transplant outcomes.

Abstract Macrophages play a pivotal role in immune responses, particularly in the context of combating microbial threats within tissues. The identification of reliable biomarkers associated with macrophage function is essential for understanding their diverse roles in host defense. This study investigates the potential of C1QA as an invariant biomarker for tissue macrophages, focusing on its correlation with the anti-microbial pathway. C1QA, a component of the complement system, has been previously implicated in various immune functions. Our research delves into the specific association of C1QA with tissue-resident macrophages and its implications in the context of anti-microbial responses. Through comprehensive systems biology and Boolean analysis of gene expression, we aim to establish C1QA as a consistent and reliable marker for identifying tissue macrophages. Furthermore, we explore the functional significance of C1QA in the anti-microbial pathway. This research seeks to provide valuable insights into the molecular mechanisms underlying the anti-microbial functions of tissue macrophages, with C1QA emerging as a potential key player in this intricate regulatory network. Understanding the relationship between C1QA, tissue macrophages, and the anti-microbial pathway could pave the way for the development of targeted therapeutic strategies aimed at enhancing the host’s ability to combat infections. Ultimately, our findings contribute to the expanding knowledge of macrophage biology and may have implications for the diagnosis and treatment of infectious diseases. One Sentence Summary C1QA is a fundamental biomarker of tissue macrophages

ABSTRACT Immunotherapies have shown great promise in pleural mesothelioma (PM), yet most patients still do not achieve significant clinical response, highlighting the importance of improving understanding of the tumor microenvironment (TME). Here, we utilized high-throughput, single-cell RNA-sequencing to de novo identify 54 expression programs and construct a comprehensive cellular catalogue of the PM TME. We found four cancer-intrinsic programs associated with poor disease outcome and a novel fetal-like, endothelial cell population that likely responds to VEGF signaling and promotes angiogenesis. Throughout cellular compartments, we observe substantial difference in the TME associated with a cancer-intrinsic sarcomatoid signature, including enrichment in fetal-like endothelial cells, CXCL9+ macrophages, cytotoxic, exhausted, and regulatory T cells, which we validated using imaging and bulk deconvolution analyses on two independent cohorts. Finally, we show, both computationally and experimentally, that NKG2A-HLA-E interaction between NK and tumor cells represents an important new therapeutic axis in PM, especially for epithelioid cases. Statement of Significance This manuscript presents the first single-cell RNA-sequencing atlas of pleural mesothelioma (PM) tumor microenvironment. Findings of translational relevance, validated experimentally and using independent bulk cohorts, include identification of gene programs predictive of survival, a fetal-like endothelial cell population, and NKG2A blockade as a promising new immunotherapeutic intervention in PM.